RNA regulierte biologische Systeme Flashcards
RNA Strukturen
- Primärstruktur = Abfolge der Nukleotide
- Sekundärstruktur = intermolekulare Basenpaarung / Interaktion
- Tertiärstruktur = einzelsträngige Bereiche interagieren mit anderen über längere Abschnitte
- Quartärstruktur = RNA-RNA und RNA-Protein
Sekundärstrukturen RNA
ssRNA kann intramolekular Wechselwirken (BP eingehen) und Strukturmotive ausbilden
- ss, ds, single nucleotide bulge, three nucleotide bulge, hairpin (stem-loop), symmetric internal loop, asymmetric internal loop, two-stem junction, three-stem junction, four-stem junction
Tertiärstrukturen RNA
nicht so stabil - schnell wieder auflösbar
- räumliche Strukturen
- H Brücken Bindungen zwischen Basenpaaren sowie Basenstaplung tragen überwiegend zur RNA-Stabilität bei
- koaxiale Basenstaplung (Kollinearisierung zweier stems), kissing hairpin, Pseudoknoten- 3 Typen: H-Typ = hairpin loop / I-Typ = internal loop / B-Typ = bulge loop => keine Knoten & über weite Distanzen
Riboswitch - Abschnitte
- 5’-untranslatierte Region (5’UTR)
- Protein-kodierender Bereich beginnend mit Startkodon (AUG) und endend mit Stoppkodon (hier: UAA)
- 3’UTR
Riboswitch - was bilden sie?
- Riboswitch liegt im 5’UTR bakterieller mRNAs (cis)
- bilden komplexe Strukturelemente
- binden hochspezifische niedermolekulare Liganden (hier: Fluorid-Ion)
- Regulation der Genexpression durch Liganden-Induzierte Bildung alternativer Strukturen
- Riboswitch-regulierte Genexpression = Riboregulation!
Riboswitch - wesentliche Strukturelemente von Riboswitches
- ohne Ligand: Struktur 1 mit BP zwischen EP und SS
- mit Ligand: Struktur 2 mit BP zwischen AD und SS
- Apamer-Domäne (AD, Sensor): 35-200 nt lang, Bindung des Liganden - benötigen Liganden für korrekte Faltung -> induced-fit Bindung
- Expressionsplattform (EP): Auslösung regulatorischen Signale, Modulation der Transkription oder Translation
- Giganten-freie und - gebundene Konformationen sind sich ausschließende Strukturen, die durch die switching-Sequenz (SS) vermittelt werden
Riboswitch - bekannte Riboswitch Liganden
- Coenzyme: Vitamin B12, TPP B1, FMN B2, THF B9
- Nukleobasen & Derivate: Guanin, Adenin, preQ1, zyklisches di-GMP
- AS: Glycin, Lysin, Glutamin
- Zucker: Glukose-6-phosphat
- Ionen: Mg2+ und F-
Riboswitch - biologische Funktionen von Riboswitches
- häufig negative Regulation durch feedback loops (feedback inhibition), seltener aktivierend
- hauptsächlich Gene, die für Proteine der Biosynthese und des Transports kodieren
- Regulation der Verfügbarkeit von Kofaktoren
- Aktivierung der Stressantworten -> bis hin zu Sterben
- Regulation diverser zellulärer Funktionen über sekundären Botenstoff c-di-GMP -> reguliert Mobilität durch zB (-) Flagellen-vermittelte Mobilität und fördert Bildung von Biofilmen
Riboswitch - Riboswitch Familie
Gruppe von RNAs, die den gleichen Giganten binden - Ligand immer SAM (Bsp: S-Adenosylmethionin bindende Riboswitch Familie)
Riboswitch - Riboswitch Klasse
Riboswitch Klassen unterscheiden sich in ihrer 2D und 3D Struktur
(Bsp: SAM-I [4 stem junction] und SAM-II [pseudoknot] und SAM-III [3 stem junction])
Riboswitch - biologische Funktion von SAM
Synthese und Transport von SAM; Biosynthese von Methionin und Cystein; Methyldonor
Riboswitch - Wirkung auf Transkriptionstermination
- off-switch: mit Ligand keine Transkription
- ohne Ligand: BP zwischen SS und EP; Ausbildung einer Anti-Terminator-Haarnadel; Fortsetzung der Transkription
- mit Ligand: BP zwischen SS und AD wg Ligand; Ausbildung einer Terminator-Haarnadel; Abbruch der Transkription
Riboswitch - Wirkung auf Translationsinhibition
- off switch
- ohne Ligand: BP zwischen SS und EP; Ausbildung eines Anti-Sequestors; RBS bleibt zugänglich; Translation
- mit Ligand: Ligandenbindung = Inhibition; BP zwischen SS und AD; Ausbildung eines Sequestors; Maskierung RBS; Inhibition der Translation
Riboswitch - Lysin-Riboswitche
- off switch -> ohne Lysin on und mit Lysin off
1. Transkriptionstermination in thermotoga maritima (gram-); Modulfunktion: gleiche AD regulieren in Abhängigkeit von Expressionsplattform die Transkription/Translation
2. Translationsinhibtion in E.coli (gram-); biolog. Fkt: Regulation der Biosynthese und des Imports von Lysin; gleiche Interaktion nur unterschiedliche Expressionsplattform
Riboswitch - Adenin-Riboswitche
- on switch -> Ligandenbindung in AD führt zu Translation/Transkription
1. Transkription in bacillus subtilis (gram+)
2. Translation in vibrio vulnificus (gram-)
Riboswitch - Beispiele für aktivierende Wirkung
Riboswitches können auch aktivierend auf die Transkription oder Translation wirken.
- Purin Efflux Pumpe (pbuE)
- hohe Adenin Konzentration führt zur Transkription bzw Translation von pbuE
- Ausscheidung von Adenin
Riboswitch - Regulation der GlmS-Genexpression
- durch Riboswitch-Ribozyme: AD & Ribozym
- Vorkommen: in gram+ Bakterien
- Mechanismus: Bindung von GlcN6P führt zur Selbst-Spaltung der mRNA, wobei ein 5’Hydroxyl entsteht; Erkennung des neuen 5’OH durch RNAse J1, Degradation der mRNA
Riboswitch - Spezifität
- Riboswitches binden hochspezifisch Liganden
- Purin-bindende Riboswitches weisen die gleiche 2D und 3D Struktur auf, können aber sehr spezifisch zwischen Guanin und Adenin diskriminieren
- Spezifität beruht auf einem einzigen hoch-konservierten Nukleotid:
1. Adenin-Riboswitch hat Uracil-74
2. Guanin-Riboswitch hat Cytosin-74
Riboswitch - Riboswitch in Eukrayonten
Thiaminpyrophosphat (TPP) - bindende Riboswitches in Algen, Pilzen, höheren Pflanzen,;
Riboswitch liegt im 3’UTR; Mechanismus ist alternatives splicing -> Degradation mRNA; Wirkung: Regulation der Expression von Thiamin C Synthetase (THIC)
bakterielle RNA Thermometer - Wirkprinzip von Heat-schock RNA Thermometern
- niedrige (optimale) Temperatur: RBS und AUG-Startcodon sind durch BP mit 5’UTR der mRNA nicht zugänglich (Maskierung RBS/AUG) -> keine Translation
- hohe Temperatur (Hitzestress): Aufschmelzen der Struktur im 5’ Bereich; RBS und AUG zugänglich; Bindung ribosomale UE (Translation)
=> gekoppeltes System: Sensor und Regulator -> direkte Reaktion
bakterielle RNA Thermometer - Allgemein
- Bakterien können Umgebungstemperatur messen
- Temperatursensoren sind kleine RNA-Elemente
- liegen in 3’ Region der zu regulierenden mRNA (cis agierende RNA-Elemente)
- Kontrolle der Expression verschiedener Stress-Gene (heat schock Gene, cold schock Gene, Virulenzgene)
- regulieren Translation
bakterielle RNA Thermometer - Aufschmelzungsmechanismus von Heat Schock RNA Thermometer
- graduelle Erhöhung der Umgebungstemperatur führt zum graduellen Aufschmelzen der gepaarten Region
- Reißverschluss (zipper) ähnlicher Mechanismus
bakterielle RNA Thermometer - ROSE
Repression of heat schock gene expression
- Sequenz im 5’ Bereich versch. Hitzeschock-Operons in gram- Bakterien
- Regulation von Genexpression von mind. 5 heat schock operons ( auch sigma32)
- Temperatur stabile 5’ hairpins (viel GC) sichern korrekte Faltung des labilen 3’ hairpins während Transkription
bakterielle RNA Thermometer - Nukleotide verantwortlich für graduelles Thermosensing
- zipper like: je höher Temperatur desto mehr Schmelzen
- ROSE: nicht Watson Crick Paare für graduelles Aufschmelzen besonders wichtig
a) 37°C Sensitivität: triplebp & UU Paarung
b) 42°C Sensitivität: GG Paarung und wobble Paarung GU in AUG
Virulenz RNA Thermometer - PfrA
- 37°C Signal für Virus, dass Warmblüter inhibiert -> Expression Virulenzfaktoren
- pfrA ist Transkriptionsaktivatpr für Virulenzgene
- off: RBS maskiert und bei 37°C on: gesamter Bereich geöffnet und Bindung der 30S UE erfolgt
- Temperaturerhöhung -> Aufschmelzen der Sekundärstruktur und RBS und Startcodon
- Ribosomenbindung möglich
- Expression von PfrA
- PfrA aktiviert Expression (aktiviert Virulenzfaktoren) von zB Adhäsionen, Phagosomen-lysierende Faktoren
Cold shock RNA Thermometer
- Folgen Temperaturerniedrigung: weniger Membranfluidität, weniger Transkription&Translation, schlechtere Faltung, weniger Enzymaktivität
- CspA: RNA Chaperon bindet an ssRNA, Adaption an niedrige Temperatur -> ist Riboswitch
RNA Thermometer vs RNA switch
- RNA Thermometer (zB heat schock): Erhöhung der Umgebungstemperatur führt zu graduellen Aufschmelzen nasengepaarter Region
- RNA switch (zB cold schock): abhängig von Umgebungstemperatur können sich zwei gegenseitig ausschließende Strukturen bilden (off-on)
Trans-kodierte RNAs (small RNAs, sRNAs) - Charakteristika
- werden an einer anderen Stelle im Bakteriengenom kodiert als ihre Ziel mRNA (trans kodiert)
- einzelne, nicht prozessierte Transkripte mit einem Rho-unabhängigen Terminator und Polyuridin Abschnitt
- nur partiell komplementär zur Ziel RNA
- benötigen oft zusätzlichen Proteinfaktor
- können diverse mRNAs targetieren
biolog. Funktion von sRNA
- Expression sRNA nur unter bestimmten Wachstumsbedingungen (oxidativer Stress, Phospho-Zucker- Stress, Nährstoffmangel, Eisenmangel)
- Regulation des Stoffwechsels, der Stressadaption und der Virulent
- negative Regulation der Translation und/oder mRNA Stabilität, seltener target Aktivierung
RNA Chaperon: Hfq
- Bindungsflächen: proximal, distal und lateral
- Funktion:
1. schützt sRNAs vor Degradation
2. fördert Duplexbildung
3. führt zur Rekrutierung RNAse E
sRNA vermittelte Translationsaktivierung
- Sigmafaktor S reguliert Gene, die bei Stress induziert werden (erfolgt via sRNA)
- stabile Haarnadelstruktur im 5’UTR: maskiert RBS & ist Substrat für Ribonuclease III
- > Spaltung nahe RBS: keine Translationsinhibition
- > Ko Bindung von DsrA-sRNA und rpoS-mRNA via hfq
- BP sRNA und stem-loop mRNA: Freisetzung RBS & neues dsRNA Substrat für RNAse III -> RBS zugänglich für Translation
sRNA vermittelte Translationsinhibition
- RNA Abbau durch RNAse III
- mRNA Bindung via loop-loop Interaktion
- Duplex I: Verlängerung des Kissing-Komplex durch Basenpaarung; Maskierung RBS
- Bildung eines Kissing hairpins (II); coaxiale Stapelung; Stabilisierung der lokalen Struktur
- Substrate für RNAse III
Eigenschaften asRNAs (cis kodierte antisense RNA)
- in gleicher DNA Region (cis kodiert)
- autonome Transkript Einheit mit Promotor und Terminator
- Transkriptlänge sehr variabel
- vollständig komplementär zur Ziel RNA (antisense)
- targetieren nur eine mRNA
- Vorkommen: mobile DNA Elemente (Plasmide, Phagen), bakterielle Genome
biologische Funktion asRNAs
- Kontrolle Replikation, Stabilität, Konjugation von Plasmiden
- Kontrolle Transposition von Transposons
- chromosomal-kodierte asRNAs: Regulation Stoffwechsel, Stressantwort, Toxinbildung
Typen von cis-kodierten asRNAs
- kurze: überlappen mit sense ORF
- lange: überlappen mehrere sense ORF (Operon)
- asRNAs, die von langen 5’ oder 3’ UTRs (nicht transplantierte Regionen) Protein-kodierender mRNAs abstammen
asRNA vermittelte Transkriptionstermination
- Regulation Eisentransport-Biosynthese Operon
- Bindung RNAbeta an wachsende polycistronische mRNA
- Hairpin Bildung führt zur Termination also Abfall RNA Polymerase
- differentielle Expression eines Operons
cis-kodierte asRNA: Translationsinhibition
- Typ I Toxin/Antitoxin System
- Sym E
- Sym R
- Regulation des TA-Systems
- Initialkontakt über 3 GC Basenpaare
- unidirektionale Ausbreitung des Duplex ausgehend von loop im nachfolgenden Helixbereich der asRNA (RNA-OUT)
- Inhibition Transposase-Translation (Duplex maskiert RBS) und Degradation mRNA via RNAse III
Was ist CRISPR Cas
Verteidigungsmechanismus von Bakterien gegen Fremd-DNA (Phasen und Plasmide) -> adaptive und vererbbare Immunität, vermittelt Resistenz gegen Eindringen von Fremd-DNA
Andere Wehrmittel von Bakterien gegen Fremd DNA
- Restriktion
- Methylierung (nicht methylierte Fremd DNA kann geschnitten werden)
Komponenten des CRISPR Cas Systems
- CRISPR array: Abschnitte sich wiederholender DNA (repeats) im Genom von Bakterien
- cas Gene: kodieren für große und heterogene Gruppe an Proteinen, beteiligt an Abwehr
CRISPR Lokus
- leader: enthält Promotor zur Transkription des CRISPR Lokus
- CRISPR Lokus: pro Bakteriengenom: 1-8
- repeats: palindromisch, seq& Länge abhängig von CRISPR Typ und Organismus
- spacer: immer umkleidet von Repeats, hypervariable Sequenzen -> kleine DNA Abschnitte, generiert durch Fremd-DNA
- protospacer: Sequentabschnitt in Fremd-DNA- Spacer im CRISPR array
- PAM: protospacer adjacent motif -> Selektion Protospacer via Erkennung d. PAM
Cas Gene - was beinhalten sie und was sind Klassen und Typen?
- beinhalten Domänen für Helikasen, Nukleasen, Polymerasen, Bindungsdomänen für DNA/RNA Nukleotide
- bilden Nukleoproteinkomplexe mit Nukleinsäuren
- 2 Klassen:
1. multiple Proteine bewirken Interferenz => Proeinkomplex
2. Einzelnes Effektorprotein bewirkt Interferenz => Abscannen Fremd DNA durch ein Protein - 5 Typen:
I: SP: Cas3 (Bakterien&Archaeen)
III: Cas10 (eher in Archaeen)
II: SP: Cas9 (Bakterien)
Mechanismus CRISPR/Cas
Phase 1: Akquisition (Adaption, Immunisierung): Erkennung Fremd-DNA nach Erstinfektion, Fragmentierung der Fremd DNA, Einbau in CRISPR Lokus als neuen Spacer (immer am 3’ Ende der leader Sequenz)
Phase 2: CRISPR Expression und Prozessierung: Expression Cas-Gene (Aufbau Überwachungskomplex), Transkription des CRISPR-Arrays zur pre-crRNA, Prozessierung zu kleinen CRISPR-RNAs (crRNA)
Phase 3: Interferenz: spezifische Erkennung und Abbau von Fremd-DNA durch Komplex aus Cas & crRNA (RNA vermittelte DNA Interferenz)
Modell der Akquisition von CRISPR-Spacer
- Fragmentierung Fremd DNA
- Selektion des Protospacers durch Erkennung der PAM (Typ1 und 2)
- Prozessierung des Spacers (Verlust PAM Sequenz)
- Spaltung des am leader-Ende liegenden repeats im CRISPR Lokus
- Integration des neuen spacers
- Auffüllen der jeweils fehlenden repeat-sequenz (repeat-verdopplung)
- Cas1 und Cas2 (Endonukleasen) bilden Komplex, der spacer- Integration bewerkstelligt
Komponenten des Überwachungskomplexes
- Cascade Typ I-E Komplex: Ribonukleoprotein Komplex crRNA & cas Proteine
- Cas9 Typ II Komplex: Ribonukleoprotein Komplex: crRNA/tracrRNA und Cas9 Protein; das crRNA/tracrRNA Hybrid wird für die korrekte Verankerung und Positionierung in cas9 benötigt
CRISPR Cas Typ I vermittelte DNA Interferenz
- Cascade Komplex sucht Fremd DNA nach protospacer mit PAM ab: PAM Sequenz liegt auf dem zur crRNA komplementären DNA Strang (target-strang)
! 2. cas8/cse1 (Protein in Cascade) erkennt PAM der target DNA - erst wenn PAM gebunden: initiale Basenpaarung zwischen crRNA-seed-sequenz und der target-DNA
- komplette BP der crRNA mit Spacer Sequenz führt zur Bildung eines R-loops
- Rekrutierung von Cas3 (Nuklease und Helikase)
- Cas3-vermittelte DNA Degradation: schneidet in Strang upstream von PAM Sequenz
CRISPR Cas Typ II vermittelte DNA Interferenz
- Cas9-crRNA-tracrRNA Komplex sucht Fremd-DNA nach protospacer mit PAMs ab. Die PAM Sequenz liegt auf dem non-target-Strang, der zur crRNA nicht komplementär ist.
- Erkennung PAM Sequenz durch CAs9 -> spez. Erkennung
- Initiale BP zwischen crRNA-seed-sequence und target DNA
- komplette BP der crRNA mit der Spacer seq der target DNA führt zur Bildung eines R-loops
- Nukleaseaktivität von Cas9 spaltet die dsDNA 3 bp upstream von PAM wobei blunt-ends in jedem Strang
- DNA Degradation durch weitere DNAsen
Anwendung CRISPR/cas und Genome editing
Phagenresistenzen in industriell wichtigen Bakterien, Knockdown oder genome editing in Eukaryonten (knock-in und knock-out):
- guide RNA: Fusion aus crRNA und trade RNA
- Doppelstrangbrüche: Reperatur durch: nicht-homologe Endverknüpfung oder homologe Reparatur
- Indels durch nicht-homologe Endverknüpfung (Deletion&Insertion) führen zum Funktionsverlust des Genprodukts (nicht kontrolliert)
RNA Interferenz (RNAi) oder Post-transcriptional gene silencing (PTGS)
kleine ds RNA Moleküle führen in Assoziation mit zellulären Proteinkomplex zur sequenzspezifischen Suppression der Target-Genexpression durch Spaltung der target-mRNA (siRNA) oder Inhibition der Translation (miRNA)
[miRNA: Translation durch bulge nach seed sequence unterdrückt // siRNA komplementär zu target RNA => durchgehende Duplex Bildung -> bulge inhibiert Spannungsaktivität von AGO]
Transcriptional gene silencing (TGS)
Inhibition der Transkription durch eigenetische Modifikation des Chromatins
Schlüsselexperimente zur Ko-Suppression homologer Gene mit C.elegans
- target Gen: umc-22 (kodiert für nicht-essentielles Myofilament Protein)
- keine/marginale Effekte mit sense und antisense RNA, aber Bewegungsdefekte mit dsRNA
- mex3 wichtig für Totipotenz der Keimzellen und Spezifikation => nach Injektion von mex3 dsRNA Verlust des natürlichen mex3 mRNA
RNA Interferenz in C.elegans:
- Systemische RNAi: Injektion von GFP-dsRNA: silencing Effekt auf Organismus
- vererbbarer RNAi Phänotyp: silencer Phänotyp wird an Nachkommen weitergegeben
RNA Interferenz Schlussfolgerungen
- effizientes gene silencing nur durch dsRNA
- spezifisch für komplementäre mRNA
- Degradation mRNA
- dsRNA muss gegen reife mRNA-Sequenz gerichtet sein, nicht gegen Promotorregionen oder Introns => Hinweis auf posttranskriptionellen Mechanismus im Zytoplasma
- bereits wenige Moleküle reichen für vollen Effekt aus -> katalytische Aktivität/Amplifikationsschritt
- Effekt kann sich im Gewebe ausbreiten (systemische RNAi) und vererbt werden
- RNAi in allen eukaryotischen Lebewesen nachgewiesen - in Säugerzellen lösen lange dsRNAs unspezifische Immunantworten aus- kurze werden toleriert und führen zur Transienten, aber sehr effizienten Suppression (knock-down)
Mechanismus RNAi
- Dicer-Prozessierung: Dicer (Endonuklease) spaltet lange dsRNA in kurze siRNA
- Bildung des RNA-induced silencing complexes (RISC): Übergabe der siRNA mit Hilfe von Dicer (+ dsRNA-bindendes Protein = dsRBD)) an Argonauten Protein (AGO)
- Guide Strang Selektion: passenger (ident zu mRNA) sense Strang wird gespalten und aus RISC entfernt
- target-mRNA-Erkennung und Spaltung: Bindung target mRNA über komplementäre BP mit guide (antisense) Strang; endonukleolytische Spaltung der mRNA durch AGO
- RISC Recycling: gespaltene target-mRNA wird aus RISC entfernt; RISC kann nur über den guide Strang weitere target-mRNA binden und spalten
Dicer
- 200 kDa
- Multidomänenprotein
- L-förmige Tertiärstruktur
- Endoribonuklease aus der RNAse III Familie
- Spaltung langer dsRNA in kurze dsRNA Fragmente (siRNAs)
-Abfolge:
Helicase, DUF, Platform, PAZ, Ruler, RNAse IIIa, RNAse IIIb, dsRBD
Argonauten Protein (AGO)
- 100 kDa
- PIWI Domäne
- katalytische Komponente von AGO
- RNAse H-ähnliche Faltung mit katalytischer Tetrade (Asp Glu Asp His)
- bilden den RNA induced silencing complex (RISC): minimaler RISC = guide RNA und AGO
Eigenschaften von si RNA Molekülen
zunächst in AGO geladen
- Monophosphat Gruppe an beiden 5’ Enden
- 2 Nukleotide Überhang und 3’ Hydroxylgruppe an beiden 3’ Enden (da durch RNAse III erzeugt)
- Spaltstelle zwischen Nukleotid 10&11 vom 5’ Ende der guide RNA
- passenger/sense Strang: identisch mit mRNA, Spaltung durch AGO2, Entfernung aus RISC, Degradation durch andere Ribonukleasen
- guide/antisense Strang: komplementär zur mRNA, definiert Spaltstelle sowohl im passenger Strang als auch in target mRNA
Anwendung RNAi
- neues experimentelles Tool zur gezielten Untersuchung spezifischer Gene (siRNA-mediated knockdown)
- Therapieansatz
- zur Bekämpfung von Pflanzenschädlingen via knockdown essentieller Gene
Antivirale RNAi (nicht im Menschen!)
- RNA dependent RNA polymerase (RdRP): Replikation von RNA anhand einer RNA Vorlage
- RNAi in elegans: Amplifikation des RNAi Effekts - Produktion von primären und sekundären siRNAs
RNAi in Pflanzen Mechanismen
- gene silencing durch exogene RNA-trigger: Virusabwehr, RdRP vermittelte Amplifikation sek. siRNA
- gene silencing endogener mRNAs durch miRNAs: Regulation Genexpression via Inhibition Translation/ RNA Degradation
- transcriptional gene silencing (TGS): DNA-Methylierung und Histonmodifikation, Transkriptionshemmung
