mRNA Biogenese und Krankheiten Flashcards
Prozessierungsschritte der mRNA
- RNA pol II (zelluläres Enzym) stellt via Transkription das primäre Transkript her
- cap Modifizierung am 5’ Ende
- pre-mRNA splicing
- 3’ end processing
- Hinzufügen von Poly(A) Schwanz am 3’ Ende
- mRNP Verpackung => mRNA als Molekül, assoziiert mit Protein
- mature mRNP via mRNA Export aus Pore und ist jetzt Translationskompetent
pre-mRNA spleißen in mRNA Biogenese (Besonderheit der Eukaryonten)
- Transkription der DNA durch RNA Pol II -> Introns müssen entfernt werden
- fertiges Transkript -> Splicosom: Introns werden ausgeloopt
- Exons werden komplett nahtlos aneinander verestert
- geht vom Nukleus ins Cytoplasma
- Ribosomen translatieren
Warum sind eukaryotische Gene unterbrochen?
- größere genetische Variabilität
a) alternatives Spleißen -> versch. Proteine aus einem Gen
b) Austausch des Exons -> neue Gene
c) post-transkriptionale Regulation der Genexpression - erhöhte Stabilität der Transkripte: kurze Exons eher intakt bei rekombinanten Events
- Exons codieren häufig für funktionale Domänen
Wie funktioniert spleißen?
- primäres Transkript hat 7-8 Introns und 8-9 Exons
- GU und AG Dinukleotide an exon-intron und intron-exon Verbindung und A Nukleotid an branch site sind universell konserviert
Katalytische Schritte des Spleißens
- A-residue am branch Point führt nukleophilen Angriff auf 5’ splice site aus
- splicing intermediates: exon-1 und lariat-exon 2
- exon 1 greift 3’ splice site an, um spliced exon und lariat intron herzustellen
Muster des alternativen Spleißens anhand des Bsp eines 12-exon Gens
- alternative Promotoren
- konstitutive Exons
- retained intron
- cassette und mutual exclusion exons
- alternative 5’ und 3’ splice sites
- alternative 3’ exons mit Polyadenylierungssite
Regulation des Spleißens -> konservierte RNA sequence Elemente
- branch point
- 5’ splice site
- 3’ splice site
- splice site des alternativen splice cassette exons
-> wichtig: exonic und intronic splicing enhancer (ESE,ISE) sowie sielencer (ESS,ISS) Elemente - beide durch Proteine gebunden
Mutationen im Spleißen können wo auftreten?
- splice site signals (gu,ag) [exon-intron junctions]
- exonic splicing enhancers (ESE) -> erhöht spleißen
- exonic splicing silencers (ESS) -> inhibiert spleißen
- intronic splicing enhancers (ISE)
- intronic splicing silencers (ISS)
Proteine, die ESE/ESS/ISE/ISS binden
ESS und ISS von hnRNP Proteinen gebunden.
ESE und ISE von SR Proteinklassen gebunden.
hnRNP und SR sind antagonistische Faktoren
Krankheitsauslösend beim spleißen sind…
- Unterbrechung von cis-acting sequence elements
Effekte in cis: Einfluss auf Expression auf demselben Gen - trans-acting Faktoren betreffend (zB SR Proteine)
Effekte in trans: Potential viele Gene zu betreffen
Mutationen
- gain-of-function mutation: beta-thalassemia und spinal muscular atrophy (SMA)
- lost-of-splicing-function mutation: exon 3 skipping
- PRPF Protein: Auswirkung auf Photorezeptoren
Spinal muscular atrophy und Therapiemöglichkeit
- C zu T Mutation in smn2 führt zu exon 7 skipping (nur full length smn2 ist aktiv)
- smn1 gen nicht vorhanden -> empfänglich für smn2 Mutationen => kodieren beide ORF -> cis acting
- Schwäche wg weniger Motorneuronen des Rückgrats und brainstems -> Muskeln können nicht funktionieren
- Muskeln am Zentrum betroffener als distale Muskeln
-RNA basierte Therapiemöglichkeit: CRISPR cas und Oligonukleotide
Funktion smn Protein (SMA)
smn Protein wichtig für Assimilierung des sm Kerns mit snRNP Biogenese
- smn protein stellt core Produkte des splicosoms mit her
- sm Kern Assemblierung ist durch smn Komplex directed
- Komplex ist ATP-abhängiges Assemblyosome erkennt 5’ und 3’ splice site
- biogenese von snRNPs hoch komplex
Duchenne Muskeldystrophy
- T/A Substitution in exon 31 von dystrophin -> premature Stop Codon und ESS -> cis acting (exon31 skipping)
- mild Duchenne = BMD (partiell funktionelles Protein)
=> cis acting
Frontotemporale Demenz (FTDP-17)
- Mutation im Exon 10 des MAPT Gen codiert Tau Protein -> Stärke der Funktionalität wird angehoben
- neuropathologische Krankheit
- Bsp: N279K Mutation: mehr ESE Funktion und mehr 4R-tan Protein Variante
=> cis acting
Cystic fibrosis
- Mutation im intronischen Bereich beeinflusst Schwere der cystischen Fibrose
- polymorphe (UG)m(U)n in 3’ splice site im CFTR gene exon 9 (skipping exon 9)
- Modifikation auch im nicht-kodierenden Bereich Auswirkungen
=> cis acting
Folgen der Unterbrechung der decoding machinery
- Retinitis pigmentosa -> Erblindung
- tri-snRNP assembly Komplex des Spliceosoms
- normales Spliceosom: U5 mit PRPF8 bindet an PRPF31 an U4/U6 mit PFPR3 und PAP1 -> Photorezeptoren
- defektes Spliceosom: U5 mit PRPF8 kann wg Mutation von PRPF31 nicht an U4/U6 binden -> keine Photorezeptoren
RNA recognition motifs für 3’ end processing (räuml. Abfolge 5’ zu 3’)
- USE = upstream sequence element
- AAUAAA = poly(A)signal
- CA = cleavage site
- DSE = downstream sequence element
3’ end processing mRNA Mechanismus
- Assemblierung des Multiprotein Komplexes an specific RNA recognition motifs
- cleavage at cleavage site by CPSF73 -> freies 3’OH Ende
- Formierung poly(A) Schwanz von PAP bound by PABP
Protein Komplexe, die an 3’ end processing beteiligt sind
- CPSF (cleavage/polyA specificity factor)
- CstF (cleavage stimulating factor)
- CFI (Cleavage Factor I)
- CFII
- PAP (polyApolymerase)
Was kann schiefgehen beim 3’end processing?
Mutationen in Sequenz Elementen
- lost-of-function (AAUAAA) -> alpha/beta thalassemias, IPEX, Fabry
- gain-of-function (CA) -> thrombophilia prothrombin/fibrinogen
- Mutation des USE
- alternative polyA Signal Erkennung
Was kann schiefgehen beim 3’end processing?
Rolle der trans-acting Faktoren
- PAP: starke Rolle bei Krebs
- PAP (lost-of-function): cell arrest in G0/G1 phase
- PAP (gain-of-function): confers high proliferative activity -> over expression in human carcinomas
Klassifizierung von alternativen Polyadenylierungen
- Type I: nur ein polyA Signal in 3’UTR -> eine mRNA
- Type II: mehrere Varianten derselben mRNA
- Type III i: alternative polyA site @upstream introns
- Type III e: alternative polyA site @upstream exons (sehr selten)
mRNP package und mature mRNP
Decodierung der mRNA mit Proteinen/ Proteinkomplexen an cap, PolyA, Exon/Exon junction
RNA Transport
- direktionaler aktiver Prozess: Richtung: Nukleus zu Cytoplasma
- durch nuclear pores
- Transportfaktoren für versch. RNA Moleküle: hauptsächlich Crm1 als Transportrezeptor aber auch Exp-t für t-RNA und Exp-5 für Prä/mi RNA
Gründe für Defekte im mRNA Transport
- Mutation in pre-mRNA Sequenzen
- > kein Export von mutierten Transkript - Mutation in export/processing factors
- > weniger Aktivität
microsatellite expansions in RNA
kann zu nuclear Retention und disease führen
- kleine Seq Einheiten häufiger wiederholt als normal
- in transcribed regionen mit RNA gain-of-function
- sowohl Exon, Intron als auch UTR
- Bsp: Huntington Disease, POI, SCA
Mechanismen durch die microsatellite Expansion zu Krankheiten führt
- Loss-of protein function, wenn Mutation im Exon
- Gain-of aberrant protein function due to expansion of triplet repeats within open reading frame / in exonischen Bereich
- Gain-of function of RNA containing expansion v.a. 3’UTR
Therapeutische Ansätze, die Target RNAs nutzen
- antisense oligonucleotides: komplementär zu exon 7 und konjugiert zu splicing enhancing effectors
- snRNAs als vehicles für Antisense RNA
- RNA interference (RNAi) greift microsatellite form an
