Rekombinante Impfstoffe Flashcards
1
Q
Aktive Immunisierung
A
- Lebend-Vakzine: Krankheitserreger ist im Wirt vermehrungsfähig und attenuiert -> langer Impfschutz; effektive AG Präsentation über MHC Klasse 1; kein Adjuvans (Lockmittel); Risiko der Erregerausscheidung und Reversion
- Tot-Vakzine: inaktiv, im Wirt nicht vermehrungsfähig -> weniger effektiv; ineffektive MHC Klasse 1 Präsentation; Wirkung abhängig von Adjuvans; keine Erregerausscheidung
2
Q
Rekombinante Lebend-Vakzinen
A
- Attenuiert: replikationskompetente Viren, attenuiert [Verlust der krankmachenden Eigenschaften] über gezielte gentechnische Veränderungen -> zB Pseudorabies
- Vektorvakzinen: replikationskompetente Viren als Vektoren kodieren zusätzliches AG: selbst avirulent, gentechnisch manipulierbar, ausreichende Kodierungskapazität/Expressionsspiegel -> zB Pocken und Herpesviren
3
Q
Virusvektoren zur AG Expression
A
Vaccinia Virus Stamm MVA (Modified Virus Ankara): abgeleitet von Impfvirus -> 570 Passagen auf embryonalen Hühnerfibroblasten: spontane Deletion von Genomsequenz
4
Q
Herstellung Vaccinia Virus mittels homologer Rekombination
A
- Klonierung von Zielgen in Vektorplasmid
- Reinigung von Virionen (Zentr. im Sukrosegradienten) -> Präparation des viralen Genoms
- Kopräzipation
- Transfektion
- homologe Rekombination (Austausch zwischen grünen Bereichen - Zielgen in Genom)
- Selektion rekombinanter Vaccinia Viren über BrdU
5
Q
Beispiel für Vektorimpfstoff (Pockenviren)
A
- Vaccinia Virus (Stamm MVA) mit Gen für Glykoprotein des Tollwutvirus
- Canarypox Virus [guter Vektor - löst keine Krankheiten beim Menschen aus] mit:
- Hämaglutiningen des Pferdeinfluenza Virus
- env und gag Gene des Katzenleukose Virus
- Glykoprotein des Tollwutvirus
Probleme: Immunreaktion gegen Vektor. Boost Effekt bei 2. Immunisierung bleibt aus.
- > Lsg: “prime-boost” Konzept:
1. Immunisierung mit Rekrutierung. Vektorvakz./
2. Immun. mit rek. AG/cDNA
6
Q
Rekombinante Proteine als “Subunit” - Vakzine
A
- in vitro rekombinant hergestellte Virusantigene (Proteine), aufgereinigt, mit Adjuvans appliziert
- Oberflächenproteine nicht behüllter Viren: nicht glykolysiert und ohne Disulfidbrücken => authentische Expression in E.coli (zB Hecolin)
- Oberflächenproteine behüllter Viren: glykosyliert & Disulfidbrücken => authentische Expression in Hefezellen (zB HBV)
7
Q
Verlauf einer HBV Infektion
A
- akute Hepatitis B
- fulminante Hepatits B: 1% der akuten Infektionen - häufig Leberversagen
- chronische Hepatitis B: 90% der perinatalen Infektionen; 5-10% der akuten Infektionen; zu 60% inapparent
8
Q
HBV Protein (subunit Vakzine) - strukturelle Kompenten
A
Hüllproteine und Kapsel und kleines Genom
-> Nutzen leere Hüllen zum Impfen - entweder Filamente oder Sphären
9
Q
HBV Protein
A
Subunit Vakzine
- selektieren viraler Antigene
- rekombinant in Hefe hergestellte HB S Antigenpartikel, effektiv und keine Kontaminationsgefahr mit infektiösen Erregern aus Blut
10
Q
HBV Probleme
A
- Hefe-KH maskieren Epitope -> rekombinanter Hefestamm mit red. Glykosylierung
- 5-10% Impfversager zusätzlich PreS1 und PreS2 Proteine wären effektiver
11
Q
Allgemein: Oberflächenproteine gehüllter Viren
A
- membranständig
- Disulfidbrücken
- komplex glykosyliert
- Immunogenität abh. von Konfirmation: Disulfidbrücken, Glykosylierung => Expression in E.coli/ Hefe nicht mögllich
12
Q
Systeme zur Proteinexpression
A
- stabile Zelllinien: permanente/ induzierbare Expression und geringere Proteinmenge
- Bakulovirus/ Insektenzellen: stärkster Promotor/partielle Glykosylierung/ rekombinante Insektenzellen mit komplexer Glykosylierung und große Proteinmenge
13
Q
rekombinantes Glykoprotein als Impfstoff
A
E2 Protein des Virus der klassischen Schweinepest
14
Q
Neue Adjuvantien
A
- Hemmstoffe gegen “Signalling Moleküle”, welche die Immunantwort negativ regulieren
- “Signalling Moleküle” (Lymphokine und Chemokine), welche Immunantwort positiv beeinflussen
15
Q
Replikationszyklus Papillomvirus
A
- stratum basale: sehr wenige Virusgenome; geringe Transkription der Gene E1 & E2
- stratum spinosum: wenige Virusgenome; Transkription der Gene E1, E2, E6, E7
- stratum granulosum: wenige Viruspartikel, viele Virusgenome; erhöhte Transkription der frühen und späten Gene
- stratum corneum: hohe Virusproduktion und Freisetzung von infektiösen Viren
16
Q
Funktion von E6/E7 in Papillomviren
A
- Regulation des Zellzyklus
- induzieren Übergang der differenzierten Epithelzellen in S-Phase, dadurch Expression zellulärer Faktoren, die virale Genomreplikation fördern
- E6 verzögert zusätzlich Indikation der Apoptose
- Expression von E6/E7 wird negativ reguliert von E2
- E6/E7 ähnliche Funktion wie large T-Antigen bei SV40
17
Q
Funktionaler Mechanismus von E6 bei Papillomviren
A
- reguliert p53 -> ohne p53 überleben Krebszellen eher als mit
- interagiert mit E6AP und p53: E6AP ist zelluläre Ubiquitin Ligase: induziert Degradation von p53
- p53 ist Tumor Suppressor/ Transkriptionsfaktor: hält ZZ in G1 bei Stress via Induktion von p21 (Inhibitor der cyclin abhängigen Kinasen -> Apoptose)
- virale Proteine E6/E6AP binden an p53
- p53 wird ubiquitiniert
- durch p53 ausgelöste Apoptose bleibt aus
18
Q
Funktionaler Mechanismus von E7 bei Papillomviren
A
- interagiert mit pRBB = retinoblastoma Genprodukt => Genprodukt sorgt für Ubiquitinierung von pRB
- pRB = Tumor suppressor: bindet und inaktiviert E2F-transactivator der cyclin Gene => verhindert Übergang von G1 zu S Phase
- E7 bindet an pRB
- pRB wird ubiquitiniert
- pRB wird im Proteasom degradiert
19
Q
Transformation durch HPV
A
- Integration des viralen Genoms an E2: ist E2 beschädigt, steigt Risiko , dass Zelle in Tumorösen Zustand übergeht (E2 reguliert Affinität zu p53&pRB negativ)
- E2 normalerweise Repressor der E6/E7 Expression
- Inaktivierung von E2 -> Überexpression v. E6/E7
- E6/E7 wirken synergistisch bei Zelltransformation
- E7 va Transformation aber Induktion der Apoptose
- E6 va Hemmung Apoptose
- Bsp: HeLa Zellen & COS & 293T
20
Q
Impfung gegen Prostata Karzinom
A
- Strategie: Immunisierung mit Prostate stem cell antigen (PSCA) via prime/boost Ansatz:
1. prime: cDNA über Gene Gun
2. boost: virales RNA Replikon basierend auf Enzephalitis (Pferde) Virus
21
Q
DNA Vakzine
A
- Klonierung des Gens unter Kontrolle eines starken Promotors
- Applikation der DNA in Muskelgewebe, weil Muskelzellen lange Lebensdauer haben
- > dort langanhaltende Expression des Antigens (AG Präsident von MHCI)
- sehr wichtig: Binden DNA an Träger (Goblpartikel, Mikrosphären) Adjuvans
- Depoteffekt
22
Q
Antikörper gegen HIV
A
- Problem: AK kaum induziert oder Epitope hoch variabel (zB V3 loop)
- Gründe:
1. virale gps stark glykosyliert (wenig immunogen) - Zucker schirmen wichtige Bereiche des Proteins vor IS ab
2. gp120 ist trimer; Monomer hat andere Konformation
3. ohne CD4 Bindung hat Trimer andere Konformation und hohe strukturelle Flexibilität - Lösung: notwendige AG-Konformation einfrieren
23
Q
Vorteile RNA/DNA Vakzine
A
- einfache Handhabung (Lagerung) - Problem bei RNA
- effektiver als Tot-Impfstoffe
- einfache Reinigung
- stabil, preiswert, schnell größere Mengen herstellbar
24
Q
Nachteile RNA/DNA Vakzine
A
- mehrfache Applikation
- weniger effizient als Lebend-Vakzine
- stark Adjuvans-abhängig
- Tumorrisiko (nicht bei mRNA); keine Erfahrung
25
Vorteile rekombinante Impfstoffe
- Attenuierung durch gezielte Manipulation des Virusgenoms (Sicherheit, Zeitersparnis)
- eine Lebend-Vakzine zum Schutz gegen mehrere Viren
- Markerimpfstoffe (Deletionsmutanten, "subunit" Vakzine) zur serologischen Unterscheidung geimpfter (AK gegen E2) und infizierter (AK gegen beide) Tiere
26
Nachteile rekombinante Impfstoffe
- Virulenzfaktoren (Immunevasionsstrategien) bei Lebendvakzine bekannt
- verwaltungstechnische Auflagen (Gentechniksicherheit, Zulassung)
- fehlende Langzeiterfahrung
