Rekombinante Impfstoffe

Question 1

Aktive Immunisierung

Answer 1

1. Lebend-Vakzine: Krankheitserreger ist im Wirt vermehrungsfähig und attenuiert -> langer Impfschutz; effektive AG Präsentation über MHC Klasse 1; kein Adjuvans (Lockmittel); Risiko der Erregerausscheidung und Reversion
2. Tot-Vakzine: inaktiv, im Wirt nicht vermehrungsfähig -> weniger effektiv; ineffektive MHC Klasse 1 Präsentation; Wirkung abhängig von Adjuvans; keine Erregerausscheidung

Question 2

Rekombinante Lebend-Vakzinen

Answer 2

1. Attenuiert: replikationskompetente Viren, attenuiert [Verlust der krankmachenden Eigenschaften] über gezielte gentechnische Veränderungen -> zB Pseudorabies
2. Vektorvakzinen: replikationskompetente Viren als Vektoren kodieren zusätzliches AG: selbst avirulent, gentechnisch manipulierbar, ausreichende Kodierungskapazität/Expressionsspiegel -> zB Pocken und Herpesviren

Question 3

Virusvektoren zur AG Expression

Answer 3

Vaccinia Virus Stamm MVA (Modified Virus Ankara): abgeleitet von Impfvirus -> 570 Passagen auf embryonalen Hühnerfibroblasten: spontane Deletion von Genomsequenz

Question 4

Herstellung Vaccinia Virus mittels homologer Rekombination

Answer 4

1. Klonierung von Zielgen in Vektorplasmid
2. Reinigung von Virionen (Zentr. im Sukrosegradienten) -> Präparation des viralen Genoms
3. Kopräzipation
4. Transfektion
5. homologe Rekombination (Austausch zwischen grünen Bereichen - Zielgen in Genom)
6. Selektion rekombinanter Vaccinia Viren über BrdU

Question 5

Beispiel für Vektorimpfstoff (Pockenviren)

Answer 5

1. Vaccinia Virus (Stamm MVA) mit Gen für Glykoprotein des Tollwutvirus
2. Canarypox Virus [guter Vektor - löst keine Krankheiten beim Menschen aus] mit:
   - Hämaglutiningen des Pferdeinfluenza Virus
   - env und gag Gene des Katzenleukose Virus
   - Glykoprotein des Tollwutvirus

Probleme: Immunreaktion gegen Vektor. Boost Effekt bei 2. Immunisierung bleibt aus.

• > Lsg: “prime-boost” Konzept:
  1. Immunisierung mit Rekrutierung. Vektorvakz./
  2. Immun. mit rek. AG/cDNA

Question 6

Rekombinante Proteine als “Subunit” - Vakzine

Answer 6

• in vitro rekombinant hergestellte Virusantigene (Proteine), aufgereinigt, mit Adjuvans appliziert
• Oberflächenproteine nicht behüllter Viren: nicht glykolysiert und ohne Disulfidbrücken => authentische Expression in E.coli (zB Hecolin)
• Oberflächenproteine behüllter Viren: glykosyliert & Disulfidbrücken => authentische Expression in Hefezellen (zB HBV)

Question 7

Verlauf einer HBV Infektion

Answer 7

1. akute Hepatitis B
2. fulminante Hepatits B: 1% der akuten Infektionen - häufig Leberversagen
3. chronische Hepatitis B: 90% der perinatalen Infektionen; 5-10% der akuten Infektionen; zu 60% inapparent

Question 8

HBV Protein (subunit Vakzine) - strukturelle Kompenten

Answer 8

Hüllproteine und Kapsel und kleines Genom

-> Nutzen leere Hüllen zum Impfen - entweder Filamente oder Sphären

Question 9

HBV Protein

Answer 9

Subunit Vakzine

• selektieren viraler Antigene
• rekombinant in Hefe hergestellte HB S Antigenpartikel, effektiv und keine Kontaminationsgefahr mit infektiösen Erregern aus Blut

Question 10

HBV Probleme

Answer 10

1. Hefe-KH maskieren Epitope -> rekombinanter Hefestamm mit red. Glykosylierung
2. 5-10% Impfversager zusätzlich PreS1 und PreS2 Proteine wären effektiver

Question 11

Allgemein: Oberflächenproteine gehüllter Viren

Answer 11

• membranständig
• Disulfidbrücken
• komplex glykosyliert
• Immunogenität abh. von Konfirmation: Disulfidbrücken, Glykosylierung => Expression in E.coli/ Hefe nicht mögllich

Question 12

Systeme zur Proteinexpression

Answer 12

1. stabile Zelllinien: permanente/ induzierbare Expression und geringere Proteinmenge
2. Bakulovirus/ Insektenzellen: stärkster Promotor/partielle Glykosylierung/ rekombinante Insektenzellen mit komplexer Glykosylierung und große Proteinmenge

Question 13

rekombinantes Glykoprotein als Impfstoff

Answer 13

E2 Protein des Virus der klassischen Schweinepest

Question 14

Neue Adjuvantien

Answer 14

• Hemmstoffe gegen “Signalling Moleküle”, welche die Immunantwort negativ regulieren
• “Signalling Moleküle” (Lymphokine und Chemokine), welche Immunantwort positiv beeinflussen

Question 15

Replikationszyklus Papillomvirus

Answer 15

1. stratum basale: sehr wenige Virusgenome; geringe Transkription der Gene E1 & E2
2. stratum spinosum: wenige Virusgenome; Transkription der Gene E1, E2, E6, E7
3. stratum granulosum: wenige Viruspartikel, viele Virusgenome; erhöhte Transkription der frühen und späten Gene
4. stratum corneum: hohe Virusproduktion und Freisetzung von infektiösen Viren

Question 16

Funktion von E6/E7 in Papillomviren

Answer 16

• Regulation des Zellzyklus
• induzieren Übergang der differenzierten Epithelzellen in S-Phase, dadurch Expression zellulärer Faktoren, die virale Genomreplikation fördern
• E6 verzögert zusätzlich Indikation der Apoptose
• Expression von E6/E7 wird negativ reguliert von E2
• E6/E7 ähnliche Funktion wie large T-Antigen bei SV40

Question 17

Funktionaler Mechanismus von E6 bei Papillomviren

Answer 17

• reguliert p53 -> ohne p53 überleben Krebszellen eher als mit
• interagiert mit E6AP und p53: E6AP ist zelluläre Ubiquitin Ligase: induziert Degradation von p53
• p53 ist Tumor Suppressor/ Transkriptionsfaktor: hält ZZ in G1 bei Stress via Induktion von p21 (Inhibitor der cyclin abhängigen Kinasen -> Apoptose)

1. virale Proteine E6/E6AP binden an p53
2. p53 wird ubiquitiniert
3. durch p53 ausgelöste Apoptose bleibt aus

Question 18

Funktionaler Mechanismus von E7 bei Papillomviren

Answer 18

• interagiert mit pRBB = retinoblastoma Genprodukt => Genprodukt sorgt für Ubiquitinierung von pRB
• pRB = Tumor suppressor: bindet und inaktiviert E2F-transactivator der cyclin Gene => verhindert Übergang von G1 zu S Phase

1. E7 bindet an pRB
2. pRB wird ubiquitiniert
3. pRB wird im Proteasom degradiert

Question 19

Transformation durch HPV

Answer 19

• Integration des viralen Genoms an E2: ist E2 beschädigt, steigt Risiko , dass Zelle in Tumorösen Zustand übergeht (E2 reguliert Affinität zu p53&pRB negativ)
• E2 normalerweise Repressor der E6/E7 Expression
• Inaktivierung von E2 -> Überexpression v. E6/E7
• E6/E7 wirken synergistisch bei Zelltransformation
• E7 va Transformation aber Induktion der Apoptose
• E6 va Hemmung Apoptose
• Bsp: HeLa Zellen & COS & 293T

Question 20

Impfung gegen Prostata Karzinom

Answer 20

• Strategie: Immunisierung mit Prostate stem cell antigen (PSCA) via prime/boost Ansatz:
  1. prime: cDNA über Gene Gun
  2. boost: virales RNA Replikon basierend auf Enzephalitis (Pferde) Virus

Question 21

DNA Vakzine

Answer 21

• Klonierung des Gens unter Kontrolle eines starken Promotors
• Applikation der DNA in Muskelgewebe, weil Muskelzellen lange Lebensdauer haben
• > dort langanhaltende Expression des Antigens (AG Präsident von MHCI)
• sehr wichtig: Binden DNA an Träger (Goblpartikel, Mikrosphären) Adjuvans
• Depoteffekt

Question 22

Antikörper gegen HIV

Answer 22

• Problem: AK kaum induziert oder Epitope hoch variabel (zB V3 loop)
• Gründe:
  1. virale gps stark glykosyliert (wenig immunogen) - Zucker schirmen wichtige Bereiche des Proteins vor IS ab
  2. gp120 ist trimer; Monomer hat andere Konformation
  3. ohne CD4 Bindung hat Trimer andere Konformation und hohe strukturelle Flexibilität
• Lösung: notwendige AG-Konformation einfrieren

Question 23

Vorteile RNA/DNA Vakzine

Answer 23

• einfache Handhabung (Lagerung) - Problem bei RNA
• effektiver als Tot-Impfstoffe
• einfache Reinigung
• stabil, preiswert, schnell größere Mengen herstellbar

Question 24

Nachteile RNA/DNA Vakzine

Answer 24

• mehrfache Applikation
• weniger effizient als Lebend-Vakzine
• stark Adjuvans-abhängig
• Tumorrisiko (nicht bei mRNA); keine Erfahrung

Question 25

Vorteile rekombinante Impfstoffe

Answer 25

• Attenuierung durch gezielte Manipulation des Virusgenoms (Sicherheit, Zeitersparnis)
• eine Lebend-Vakzine zum Schutz gegen mehrere Viren
• Markerimpfstoffe (Deletionsmutanten, “subunit” Vakzine) zur serologischen Unterscheidung geimpfter (AK gegen E2) und infizierter (AK gegen beide) Tiere

Question 26

Nachteile rekombinante Impfstoffe

Answer 26

• Virulenzfaktoren (Immunevasionsstrategien) bei Lebendvakzine bekannt
• verwaltungstechnische Auflagen (Gentechniksicherheit, Zulassung)
• fehlende Langzeiterfahrung