REPLICAZIONE DEL DNA Flashcards
REPLICAZIONE- ipotesi
QUALI SONO LE IPOTESI SULLA REPLICAZIONE DEL DNA?
varie sono state le ipotesi sulla replicazione del DNA:
La replicazione conservativa, in cui si mantiene intera la molecola di DNA originaria generando una molecola interamente nuova.
La replicazione dispersiva, in cui si ha la produzione di due molecole i cui filamenti sarebbero costituiti da frammenti di DNA vecchio e neo sintetizzato dispersi lungo ogni filamento
La replicazione semiconservativa, secondo cui le cellule figlie avrebbero ereditato in maniera identica il 50% di elica della cellula madre e il 50% di molecola sarebbe stata neo-sintetizzata
Da ricordare: la molecola di DNA può essere denaturata tramite altre temperature o alti sali. In questi casi si possono osservare i due filamenti sciolti e separati, in quanto inizialmente appaiati tramite ponti deboli. Bisogna tener conto che la denaturazione però non è un processo permanente in quanto in condizioni particolari può essere seguito da una rinaturazione, con la formazione di nuovi legami di idrogeno.
FORCELLA DI REPLICAZIONE
La forcella di replicazione, anche chiamata forca o bolla è il sito in cui inizia la separazione dei due filamenti di DNA. Essendo le basi azotate legate da ponti di idrogeno, legami abbastanza deboli non c’è bisogno di grande energia per separarle, pertanto i catalizzatori di questa reazione servono per separare la doppia elica in due filamenti distinti (è bene ricordare che le SSBP, sono le proteine responsabili al mantenimento dell’elica aperta).
Tutto ha inizio nella forca di replicazione: all’interno della bolla, le forcelle sono due e si muovono normalmente in direzione e anti parallele (non sempre).
Nel Dna batterico è presente un’unica forca di replicazione, nel DNA eucariotico le forcelle sono molteplici, Che agiscono nella parte di DNA che deve essere trascritta (circa il 2%).
Il sito di inizio della replicazione, all’interno della forcella di replicazione, si trova a livello dei siti ricchi di adenina e timina, legati da soli due legame di idrogeno, dunque più facili da aprire.
Essendo anche paralleli ci sono due modi di sintetizzare il filamento 5’ o 3’ e il filamento è un 3’ 5’ del DNA parentale, dunque siccome alla forca di replicazione ma in entrambe le direzioni ci sarà sempre un filamento che viene sintetizzato verso l’apertura della bolla e uno che viene sintetizzato in maniera opposta.
Tuttavia questo non avviene sempre:
1 nel caso in cui ci siano due origini di replicazione con due estremità che stanno crescendo, viene sintetizzato solo il filamento Superiore da una parte e il filamento inferiore dell’altra.
2 nel caso di una forcella che si apre un’unica direzione la replicazione avviene su entrambi i lati, sia nel filamento Superiore che in quello inferiore,
Ci sarà un filamento superiore con sintesi continua verso la forca di replicazione ma con sintesi discontinua verso l’altra forca di replicazione e lo stesso vale per il filamento inferiore, il quale, dove il superiore ha sintesi continua avrà sintesi frammentata e viceversa.
La bolla di replicazione va sempre divisa in quattro quadranti: il primo considerato in alto a destra in cui si osserva il filamento lagging, sul quale la replicazione è frammentata, mentre si osserva il corrispettivo il quarto quadrante in cui la polimerasi non si stacca, e viene identificato come filamento leading.
Da ricordare: per ogni filamento che inizia c’è almeno una polimerasi, sul filamento leading 5’-3’ non si stacca, sul filamento lagging 3’-5’ si stacca e si attacca in più punti.
ENZIMI DELLA REPLICAZIONE- quali sono
forcella di replicazione
-DNA ELICASI
-SSBP
-TOPOISOMERASI
-PRIMASI
-DNA POLIMERASI
si creano frammenti di okazaki
-DNA LIGASI
ENZIMI DELLA REPLICAZIONE- DNA polimerasi
DNA POLIMERASI
RICORDA: SINTETIZZA IL FILAMENTO 5’3’ A PARTIRE DAL FILAMENTO 3’5’
L’enzima più importante della sintesi del DNA è di certo la DNA polimerasi.
Nel batterio sono stati individuati tre tipi di DNA polimerasi: 1,2,3. questi si occupano di sintetizzare il DNA e ripararlo.
Nel caso invece degli eucarioti sono stati individuati circa cinque tipi diversi di polimerasi, con le stesse funzioni del procariotico, di cui alcune presenti nel DNA nucleare e una polimerasi che si occupa del DNA mitocondriale, ereditato dalla madre. Ognuna di queste è una funzione specifica:
alfa: e quella che si occupa dell’inizio della sintesi del DNA ,Anche detta polimerasi Alfa, corrisponde alla primasì. essa sintetizza infatti il primer a RNA iniziando la sintesi del DNA del filamento principale, ma soprattutto quello del ritardato punto
beta: si occupa della funzione di proofreading
gamma: È quella mitocondriale
Delta: È predisposta al filamento lagging
Epsilon: si occupa principalmente del filamento leading.
la funzione della DNA polimerasi è quella di polimerizzare il DNA dal 5’ al 3’. Due sono le principali limitazioni della DNA polimerasi:
1 va in un’unica direzione
2 non può iniziare la sintesi dal nulla, necessita un innesco a differenza dell’RNA polimerasi, che sanno iniziare la sintesi anche da un singolo filamento.
Per quanto riguarda la struttura della DNA polimerasi si può definire che assomiglia ad una mano. Dal punto di vista biochimico la DNA polimerasi crea dei legami covalenti fosfodiesterici tra nucleotidi successivi, usa ATP che scinde in ADP +fosfato inorganico per creare questo legame tra due nucleotidi. Tutto questo lo fa a partire da un primer, un filamento di DNA innescato in direzione cinque primo tre primo. All’interno della DNA polimerasi ci sarà il nucleotide entrante con il tre fosfato (il filamento di stampo che è stato aperto), e sulla base del nucleotide che si trova, di fronte la polimerasi inserirà la base azotata con il nucleotide corretto. Dunque la polimerasi è un enzima che catalizza l’inserimento di un nucleotide trifosfato, taglia il legame 3’ dello zucchero, taglia il trifosfato che entra e lo aggancia al 5° del nuovo nucleotide: In questo modo si avrà sempre 5’-3’ fosfato zucchero fosfato zucchero. Tutte le DNA polimerasi conosciute sintetizzano il nuovo filamento in direzione 5’- 3’ aggiungendo deossiribonucleotidi (dNTP) al gruppo 3’-OH del deossiribosio del nucleotide precedente. Per ognuno di questi inserimenti una molecola di fosfato inorganico verrà rilasciata nel citoplasma.
Come fa la polimerasi a riconoscere il legame corretto? la DNA polimerasi non riesce a riconoscere le basi, ma va a tentativi. Il nucleotide che meglio si appaia, con l’energia di legame più bassa, sarà quello corretto. Esistono chiaramente degli errori della polimerasi.
Come cresce la catena? Tutte le DNA polimerasi conosciute sintetizzano il nuovo filamento in direzione 5’- 3’ aggiungendo deossiribonucleotidi (dNTP) al gruppo 3’-OH del deossiribosio del nucleotide precedente. La catena cresce dal cinque primo altre primo: viene agganciato uno zucchero in posizione 3° dello zucchero del nucleotide precedente, viene staccata la molecola di fosfato, che viene agganciata Oltrepò dello zucchero.
La polimerasi non si dirige soltanto in direzione 5’3’, ma può anche andare in direzione tre primo cinque primo con funzione di proofreader, cioè come correttore di bozze. E’ infatti in grado di rileggere la catena e rimuovere eventualmente un appaiamento errato.
ENZIMI DELLA REPLICAZIONE- SSBP
le ssbp, single Strand binding proteins, sono dei monopoli di proteine che si legano al filamento del singolo DNA, agendo in maniera cooperativa al fine di tenere il filamento disteso e separato dal suo Antipa parallelo, facilitando così l’interazione con il primer di RNA in entrambe le direzioni.
ENZIMI DELLA REPLICAZIONE- TOPOISOMERASI
Abbiamo poi le topoisomerasi, che prevengono annodamenti e super avvolgimenti (Questi si possono creare ogni volta che si apre l’elica, sei replicazione che è in trascrizione) del DNA, e hanno una funzione di riduzione dello stress dell’elica.
Perché sono considerate pericolose? perché di solito queste strutture sono assunte dall’RNA per silenziare il messaggio o per essere degradato: Il messaggero, infatti, può appaiarsi con un altro messaggero per formare dimeri di DNA, tipiche strutture a forcina, e vengono disintegrati. Dunque è possibile che questa struttura che si crea del DNA durante la replicazione possa essere riconosciuta dalla cellula come qualcosa di anomalo e possa essere rimossa completamente. Possono esistere avvolgimenti positivi o negativi.
le topoisomerasi si dividono in due grossi gruppi e hanno delle funzioni differenti:
- topoisomerasi 1: tagliano uno solo dei due filamenti di DNA, sono in grado di legarsi in maniera covalente al DNA, altrimenti l’elica scivolerebbe. In questo caso può tagliare e richiudere in maniera precisa l’elica senza che lo Strand di DNA tagliato possa attivare dei segnali di pericolo. Dunque la topoisomerasi uno taglia, rilega un singolo filamento di DNA. Si lega ad un punto specifico del DNA, tagliando uno dei filamenti, in questo modo si può rilasciare la tensione, e poi rilega la chiusura. Molecolarmente parlando la topoisomerasi ha la amminoacido tirosina nel suo sito attivo, si lega in modo covalente con uno dei due filamenti del DNA, rompe il legame fosfodiesterico, e usa questo fosfato per legarsi in maniera covalente uno dei due filamenti. A questo punto il filamento è rotto, esso può rotolare su se stesso rilasciando la tensione.
Il legame covalente tra la topoisomerasi e il DNA fa sì che una volta che l’elica ha ristabilito il livello energetico, utilizza una molecola di ATP per richiudere il legame fosfodiesterico saldando il buco che si è creato: l’elica si richiude senza che vi siano stati inseriti i nuovi nucleotidi o che se ne siano persi altri.
Il taglio non avviene a livello della backbone della struttura del DNA, ma viene a livello dei nucleotidi.
- le topoisomerasi 2 hanno una doppia funzione, ovvero tagliano la doppia elica. A differenza della Uno la due crea un legame covalente con entrambi i filamenti. l’anello Infatti risulta aperto, ma per evitare di perdere le due estremità, la due, attua un protein Gate, il quale funziona da passaggio per liberare il plasmide mantenendo salde le due estremità del plasmide iniziale.Così essa aiuta il passaggio della seconda doppia elica attraverso la prima doppia elica. Una volta separate, la seconda doppia elica andrà verso il suo destino, mentre la topoisomerasi, che deve occuparsi di richiudere il GAP, ricreerà i legami fosfodiesterici nei due filamenti.
Mentre la uno si occupa di tagliare il singolo filamento, la due riesce a separare due eliche di DNA, riuscendo a creare un DNA con tensione Inferiore.
ENZIMI DELLA REPLICAZIONE- DNA ligasi
A questo punto interviene la DNA ligasi, con la funzione di tappabuchi, essa infatti lega assieme i frammenti di okazaki, richiudendoli.
ENZIMI DELLA REPLICAZIONE- elicasi
La DNA elicasi. L’elicasi ha la funzione di spalancare la doppia elica muovendosi assieme alla polimerasi. Essa è il primo enzima a intervenire: lega entrambi i filamenti alla bolla di replicazione e ruota assieme al DNA per srotolare l’elica. Nei batteri la velocità è di 500 nucleotidi al secondo, è importante che lo srotolamento sia corretto al fine di evitare delle doppie rotture d’elica. Di conseguenza, se si muove l’elicasi, l’elica si muoverà a sua volta, e dovrà ruotare di 50 volte al secondo. Essa è un enzima che richiede ATP per srotolare.
ENZIMI DELLA REPLICAZIONE- primasi
la primasi, polimerasi Alfa, ha la funzione di polimerizzare dei nucleotidi di rna, sintetizzando brevi sequenze di RNA di circa 10 nucleotidi chiamati inneschi o primer. Essendo di RNA Essi non avranno la timina bensì l’uracile. La primasi è funzionale alla DNA polimerasi e crea Infatti il primer che potrà iniziare la polimerizzazione di ibrido RNA-DNA operata dalla DNA polimerasi.
FRAMMENTI DI OKAZAKI
i frammenti di okazaki Sono dei brevi frammenti di DNA sintetizzati attraverso la DNA polimerasi a partire dal filamento lagging, durante la replicazione del DNA, e a partire da un primer di RNA.
PERCHE’ IL PRIMER DEVE ESSERE DI RNA E NON DI DNA?
perché il Primer deve essere RNA e non ha DNA?
perché probabilmente è un segnale univoco per la polimerasi per iniziare la polimerizzazione, altrimenti potrebbe legarsi ovunque, se fosse capace di riconoscere DNA, sul growing DNA, anche i telomeri. e quindi riconoscibile, e sostituibile.
ESONUCLEASI
a questo punto entra in gioco l’esonucleasi, che rimuove il frammento di RNA.
ACCORCIAMENTO TELOMERI
I telomeri sono piccole porzioni di Dna che si trovano alla fine di ogni cromosoma. La parte terminale del Dna è molto instabile: si degrada chimicamente ed è soggetta a ricombinazioni più frequenti del resto della molecola. La funzione dei telomeri è quella di impedire all’elica di sfibrarsi.I telomeri non contengono informazioni genetiche significative per l’espressione di una certa caratteristica. Hanno invece un importante ruolo (non ancora del tutto compreso) nel determinare la durata della vita di ciascuna cellula. Per esempio, si accorciano costantemente a ogni duplicazione. Nella maggior parte dei mammiferi la sequenza telomerica è sempre la stessa, ed è TTAGGG.
Non tutte le cellule però perdono i telomeri: ricordiamo infatti le cellule staminali, e le cellule germinali, le quali hanno un enzima, la telomerasi, che al suo interno contiene un frammento ad RNA che possiede la sequenza complementare alla regione dei telomeri punto la telomerasi è quindi la funzione di catalizzare l’allungamento del filato.
DUPLICAZIONE/ REPLICAZIONE
bisogna tener presente che questo processo non è a step ma è molto caotico durante la fase S nel nucleo o nei mitocondri.
La duplicazione (o replicazione) è il meccanismo attraverso cui il DNA produce una copia di sé. Ogni volta che una cellula si divide, l’intero genoma deve essere duplicato per poter essere trasmesso (tramite mitosi o meiosi) alle cellule figlie. Il meccanismo della replicazione è complesso e richiede l’intervento di numerosi fattori.
Fasi della duplicazione
1. La duplicazione inizia in un ben preciso punto della molecola del DNA, detto punto di origine della replicazione, caratterizzato da una sequenza di nucleotidi che contengono molte basi AT (…queste sequenze si aprono con relativa facilità). Negli eucarioti i punti di origine sono multipli (20-80, distanziati tra loro da 30-300.000 nucleotidi).
2. Nei procarioti, in corrispondenza di questa regione del DNA si legano circa 20 proteine, dette DNA- A. In seguito a ciò, il DNA si avvolge attorno a queste, formando un anello (loop), con conseguente apertura della doppia elica, per un breve tratto. Negli eucarioti, il processo di inizio è più articolato e vede coinvolto un complesso di riconoscimento del punto di origine (ORC) ed una serie di altre proteine.
3. Sulla zona di apertura della doppia elica si innescano, da una parte e dall’altra, una molecola di elicasi, un enzima che separa i filamenti del DNA mediante rottura dei legami di idrogeno tra le basi azotate. Questo enzima avanza alla straordinaria velocità di circa 1000 nucleotidi al secondo ed utilizza l’ATP quale fonte di energia.
4. L’intervento della elicasi determina il distacco delle proteine del processo di inizio (DNA-A nei procarioti e ORC + altre proteine negli eucarioti) e l’aggancio di nuove proteine, dette proteine SSB (single strand binding = … che si legano al singolo filamento). Queste proteine servono a distendere e far mantenere distaccati i due filamenti del DNA, per evitare che riformino l’alfa-elica o che formino una forcina (…che interromperebbe il processo di duplicazione).
5. Dopo l‘apertura del DNA, interviene la primasi, un enzima che, legato all’elicasi ed attivato da quest’ultima, sintetizza un piccolo frammento di RNA (primer), lungo 7-10 nucleotidi. Il primer ha un terminale 3-OH che serve da innesco alla DNA-polimerasi (vedi dopo), per agganciarsi e copiare il filamento del DNA.
6. L’enzima deputato alla duplicazione del DNA è la DNA-polimerasi III. Questo enzima, però, non è in grado, da solo, di copiare il DNA e formare un nuovo filamento ma riesce solo ad allungare un filamento già esistente (come il primer prodotto dalla primasi) che gli fornisca un 3’-OH libero. Un’altra limitazione della DNA-polimerasi è quella di poter procedere solo in direzione 5’3’ e non in senso opposto (3’5’) (N.B: la direzione è riferita al frammento di DNA da sintetizzare e non a quello d’origine). La DNA-polimerasi III è dotata di proof-reading, attraverso il quale l’enzima esercita un controllo dei nucleotidi sintetizzati. Negli eucarioti opera una sola DNA-polimerasi III per il filamento leading e diverse DNA-polimerasi III per la duplicazione del filamento lagging … e precisamente, una per ogni loop formato (vedi dopo).
7. I vincoli imposti dalla DNA-polimerasi III complicano notevolmente il processo di replicazione del DNA. Infatti, mentre su uno dei due filamenti (quello posto in direzione 3’5’ e chiamato leading) la sintesi avviene in maniera continuativa (cioè, senza interruzioni), sull’altro filamento (quello posto in direzione 5’3’ e chiamato lagging) essa avviene in maniera discontinuativa, cioè attraverso la formazione di piccole catene di DNA (di 100-200 nucleotidi), dette frammenti di Okazaki.
8. Inoltre, le due DNA-polimerasi III si muovono nella stessa direzione (assieme alla elicasi). Per cui, la sintesi contemporanea dei due filamenti, in direzione 5’3’, può avvenire solo grazie alla formazione di un’ansa (loop) da parte del filamento lagging.
9. Un complesso proteico (clamp = morsetto, fascetta) interviene per stabilizzare il legame della DNA- Polimerasi III col filamento del DNA. Ci sono due clamp diversi, uno per la DNA-Polimerasi III del filamento leading ed uno per quella del filamento lagging. Entrambi sono tenuti assieme da un clamp loading ed è questo il motivo principale per il quale le due DNA-Polimerasi III si muovono nella stessa direzione.
10. Successivamente, i primer di RNA vengono elimanti da un enzima chiamato RNAsi-H e sostituiti da frammenti di DNA ad opera della DNA polimerasi I1 che, come la Polimerasi III, si muove in direzione 5’3’ (e solo in questa) ed ha bisogno di un aggancio 3’-OH per poter operare. La DNA- polimerasi I del segmento leading è sempre la stessa mentre quella per il frammento lagging cambia per ogni nuovo frammento di Okazaki (a causa del loop).
11. Il primer dell’estremità 5’ non può essere sostituito dalla DNA-polimerasi I perché non avrebbe nessun aggancio 3’OH su cui innestarsi. In realtà, il primer 5’ terminale corrisponde alla sequenza nucleotidica dei telomeri (TTAAGGG). Pertanto, in questo caso si verifica una duplice eventualità.
Specificatamente: Nelle cellule somatiche, esso non viene sostituito da un equivalente frammento di DNA, per cui il DNA neo-sintetizzato si accorcia di un po’; Nelle cellule germinali, invece, il primer in posizione 5’-terminale viene sostituito dalla Telomerasi (un enzima particolare capace di sintetizzare DNA partendo da una sequenza interna di RNA … e per questo è una trascriptasi inversa). Tutto questo spiega perché nelle cellule somatiche i telomeri si accorciano ad ogni replicazione mentre nelle cellule germinali no (… in quanto le prime non sono dotate dell’enzima telomerasi mentre quelle germinali ne sono provviste).
- Infine, i neo-filamenti di DNA vengono saldati tra loro dalla ligasi.
Un ruolo importante nella replicazione del DNA ce l’hanno le Topoisomersi. Infatti, lo svolgimento della doppia elica da parte dell’elicasi porta il DNA a valle dell’apertura ad attorcigliarsi notevolmente e a formare delle anse secondarie … tanto da creare problemi per l’intero processo di replicazione.
A far fronte a questo problema ci pensano le Topoisomerasi I e II.
La topoisomerasi I agisce su uno dei due filamenti del DNA, rompendo una sola delle catene del DNA. Poi, ruota la catena interrotta attorno a quella integra (per “disattorcigliare” il DNA a valle) ed infine riunisce nuovamente le estremità interrotte. Il punto dell’interruzione è il legame tra gruppo fosfato e desossiribosio; sia la rottura che la successiva cucitura avvengono senza dispendio di energia (conservando l’energia del legame tra gruppo fosfato e desossiribosio e cedendola al momento della cucitura).
La topoisomerasi II, invece, agisce su entrambi i filamenti del DNA, effettuando dapprima un
legame covalente con essi, poi un taglio transitorio di entrambe le catene ed infine una ricucitura.
La topoisomerasi II interviene nelle anse secondarie del DNA. Attraverso il doppio taglio dei due filamenti di DNA di uno dei due rami dell’ansa, fa passare l’altro ramo dell’ansa attraverso l’interruzione e svolge così l’ansa. Il tutto richiede 2 molecole di ATP.
Caratteristiche generali della duplicazione
Tre importanti caratteristiche del processo di duplicazione del DNA sono le seguenti:
È un processo bidirezionale (cioè avviene in entrambe le direzioni);
È un processo di tipo semiconservativo (cioè, le molecole “figlie” consistono ognuna di un filamento di DNA della molecola “madre” e di un filamento di nuova sintesi);
È un processo estremamente preciso (la DNA-polimerasi fa un errore ogni miliardo di basi
sintetizzate).
È un processo rapido (50 nt/sec).
