MECCANISMI DI RIPARAZIONE DEL DNA Flashcards
CAUSE ERRORI AL DNA- fattori interni
Meccanismi di riparazione della polimerasi (NER- Nucleotide Excision Repair)
È noto che la stessa polimerasi può commettere errori, ogni 10 alla sesta /10 ^ 9 base aggiunte, ma molti di essi vengono corretti dalla polimerasi stessa. se ciò non avvenisse per ogni ciclo di replicazione si accumulerebbero circa un migliaio di mutazioni, nel caso di cellule umane. Questo è un esempio di causa interna di danno al DNA.
il primo meccanismo di correzione degli errori che si analizzerà e la funzione proofreeding della DNA polimerasi, nel momento in cui essa va in direzione tre primo cinque primo. si sa che la polimerasi ha la forma simile a quella di una mano nella quale sono presenti numerosi siti attivi, ognuno dei quali presenta una funzione diversa: polimerizzazione e correzione dell’errore. Dunque il filamento scorrerà nella polimerasi, a seconda del verso in cui essa si muove e del compito che sta svolgendo, si attiveranno siti attivi diversi.
il sistema della correzione degli errori è basato sulla stessa struttura del DNA. si noti che i legami ad idrogeno che si vanno a formare tra le basi sono molto più stabili di tutte le interazioni che si possono venire a creare, di conseguenza un errato appaiamento delle basi Porta alla formazione di un ponte di idrogeno meno stabile o che direttamente non si riesce a formare.
quando la Polimerasi si troverà di fronte ad un errato accoppiamento di base, che porta a un ponte di idrogeno meno stabile o assente, non creerà il legame fosfodiesterico: questo porta la riduzione immediata degli errori ( si Ricorda inoltre che la polimerasi va a tentativi Quindi nel caso errato accoppiamento di base sarà meno propenso a creare il legame fosfodiesterico).
Come funziona nel dettaglio il meccanismo di riparazione della polimerasi?
Ci troviamo nella duplicazione del DNA dove agiscono tutti i complessi enzimatici visti precedentemente
1 Si ammette che ci sia stato un errore di accoppiamento, Ciò comporta Che il nucleotide non si posiziona correttamente, quindi tende a formare legame di idrogeno Instabili e successivamente a distruggerli: quando la polimerasi arriverà a questo punto non sarà propenso a creare il legame fosfodiesterico tra nucleotidi e adiacenti, Dunque tornerà indietro e, grazie alla sua capacità di correzione di bozze, lavorando in direzione tre primo cinque primo, staccherà il nucleotide errato.
2 successivamente arriverà un nuovo nucleotide, presumibilmente quello corretto e si verranno a creare dei ponti idrogeno stabili con il nucleotide che trova di fronte.
3 a questo punto è molto più probabile che la polimerasi riesca a catalizzare la formazione del legame fosfodiesterico.
è Importante sottolineare che questo metodo è alla base di tutti gli altri metodi di correzione di bozze, ma con alcune differenze: magari non verrà soltanto rimosso un nucleotide ma una decina di essi o un grande pezzo di DNA punto più DNA si rimuove più il meccanismo è complicato e rischioso per la cellula.
COSA SI FA SE NON FUNZIONANO I PROOF READING? -fattori interni
se non funzionano i proofreding? è facile capire che se sono presenti anomalie nei sistemi di correzione di bozze, ovvero sono presenti delle mutazioni In tali sistema, le sintomatologie saranno decisamente più complesse
(nel caso in cui il sistema Ber, nucleotide excision Repair) ovvero il profreeding della polimerasi, non funzioni, molto spesso la cellula non è in grado di rispondere ai danni riguardanti la duplicazione del DNA e il paziente risulterà essere fotosensibile a livello dei tessuti che possono essere esposti Ai raggi UV: tale problema spesso si tramuta in forme tumorali.
altri generi responsabili della correzione degli errori Sono il BRCA1 e il brca2 quali sono anche responsabili della repressione di Tumori familiari. nel momento in cui essi sono mutati la cellula non è in grado di eliminare i superavvolgimenti del DNA, il lavoro eseguito dalla topoisomerasi 2, e ciò evolve in forme di tumore al seno e alle ovaie.
CAUSE ERRORI AL DNA- fattori esterni
Oltre agli errori della polimerasi sono presenti una serie di fattori esterni che possono indurre danni al DNA punto Alcuni esempi sono: i raggi uv, gli agenti alchilanti( che inducono danni al DNA e per questo sono usati nelle chemioterapie), le radiazioni ionizzanti e i composti cancerogeni.
Ognuno di questi fattori può causare un diverso danno al DNA:alcuni possono colpire la doppia elica, altri colpiscono in maniera specifica le basi azotate punto
Uno dei danni più comuni è la rottura del doppio filamento, indicata con la sigla dsb, ovvero Double Strand Brake, o la rottura del singolo filamento, SSB, single strand Break. quest’ultimo è danno meno grave, in quanto almeno uno dei due filamenti è rimasto intatto punto
Per quanto riguarda i danni che colpiscono in maniera specifica le basi azotate, due esempi sono l’aggiunta di un gruppo metile all’adenina e la formazione di legami indesiderati come link tra di base adiacenti o tre basi sui filamenti opposti non corrispondenti.
CAUSE ERRORI AL DNA- fattori esterni- esempio: intra-strand crosslinking
intra-strand crosslinking
L’esempio più classico riguardante i danni che colpiscono in maniera specifica le basi azotate, dovuti a causa esterne prevalentemente, sono i dimeri di timina. Normalmente a livello del DNA si trovano delle sequenze in cui si ripetono delle timine: l’esposizione a raggi uv tende a portare questo tipo di cross-linking interno tra le due timidine, solo se le due timine sono adiacenti. se per esempio troviamo quattro tipi linee adiacenti, è possibile trovare due dimeri.
-se tu ricomponi la doppia elica hai storcimento della doppia elica per presenza legame covalente tra le timine e si tagliano
- rischi di leggere il dimero come una sola base e creare mutazione puntiforme
SISTEMI DI RIPARAZIONE DNA
Nella maggior parte dei casi i danni al DNA non sono reversibili, e questo di solito è considerato un bene in quanto nel momento in cui la machinery della cellula percepisce un danno, la cellula muore e l’errore non viene portato avanti nelle divisioni successive. In alcuni casi invece il danno è considerato reversibile e può essere corretto. Ciò può essere attuato per danni considerati piccoli, cioè se si ha un risparmio energetico del correggere l’errore piuttosto che portare a morte l’intera cellula stessa. Nel caso di questi errori reversibili per la correzione non viene utilizzato l’altro filamento come stampo e il sistema agisce autonomamente.
I danni possono essere più facilmente reversibili e più importanti. Per quanto riguarda la correzione dei danni più facilmente reversibili si utilizza il Direct reversal Repair, mentre per i danni più importanti ci si serve del base excision Repair( Ber), del mismatch Repair, del nucleotide excision Repair ( ner).
SISTEMI DI RIPARAZIONE DNA- danni facilmente reversibili - direct reversal repair
Direct reversal Repair.
questo metodo di riparazione del DNA viene utilizzato in caso di fotoattivazione o della rimozione dei gruppi metile. Può capitare infatti che la guaina venga metilata per cause esterne alla cellula. questo creerà delle storture nella struttura e nell’appaiamento. Al fine della correzione di questo errore la cellula attiverà un enzima detto metiltransferasi che si occupa di spostare il gruppo metilico su un’altra base o proteina che necessita di essere metilata.
Questo meccanismo è molto frequente nei casi di epigenetica
nell’imprinting questo meccanismo viene sfruttato per metilare zone del DNA ricche di guaina e citosina e permettere così la regolazione della trascrizione di certe sequenze. Questo è un processo scoperto di recente che permette l’attivazione o il silenziamento di certe sequenze specifiche: quindi una zona metilata verrà silenziata, mentre una demetilata verrà attivata e trascritta. Si attiva il Direct reversal Repair solo in determinate zone della cellula dove la metilazione viene vista come qualcosa di indotto da meccanismi esterni e quindi verrà corretto col meccanismo sopra descritto.
SISTEMI DI RIPARAZIONE DNA-danni più gravi - base excision repair
Excision Repair
(come è stato già accennato alcuni danni non solo indotti da Fattori esterni bensì dalla stessa polimerasi) UTILIZZATA PER MODIFICAZIONI CHI ICHE DELLA STRUTTURA. in questo caso verrà poi eseguito il taglio di una base, di un nucleotide o di un breve frammento O pezzo di cromosoma. Due sono i metodi che approfondiremo : il ber, base excision Repair, e il ner, nucleotide excision Repair.
il BER è il più semplice dei meccanismi taglia e cuci punto si ammette che la polimerasi ha commesso un errore a livello di una base:
-Interviene un enzima detto glicosilasi, che permette l’estrusione della base errata, esponendola all’esterno dell’elica. Così facendo lo stesso enzima potrà andare a tagliare la suddetta base lasciando solamente lo zucchero
-Interviene a questo punto l’endonucleasi -AP che riconosce il GAP lasciato dalla base tagliata e si lega nel sito vuoto, creando un taglio nel DNA
-questo taglio serve da invito per un per un terzo enzima chiamato DNA fosfodiesterasi, il quale Elimina il residuo di zucchero: ci si trova di fronte ad un break
-Interviene a questo punto la DNA polimerasi, che usa il doppio filamento di DNA attaccato al Gap come primer ed inserisce il nucleotide mancante ?
-agisce adesso la DNA ligasi che crea il legame tra le basi adiacenti?
Sistema di riparazione che interviene in diversi tipi di lesioni responsabili di una distorsione della doppia elica del DNA. In particolare, il colpevole di tali alterazioni è rappresentato dalle radiazioni ultraviolette e dai numerosi fotoprodotti a cui quotidianamente danno vita sul DNA. Tra questi, i più frequenti sono senza dubbio i dimeri di pirimidina, che si generano in seguito alla formazione di legami covalenti tra due pirimidine (T o C) sullo stesso filamento.
Il ner, è caratterizzato da danni più drastici, mentre la causa del Ber era la polimerasi, qui vi sono danni indotti da raggi uv a carico delle pirimidine. In questo caso non è solo la base ad essere errata, e si creano delle vere e proprie distorsioni all’interno della doppia elica. per esempio si ammette che il danno è indotto dai raggi UV si ha un numero di pirimidine, simile al dimero che si crea tra le tra le timine, Ma anche questa volta salta un nucleotide (per esempio tra A e T, ma saltando un nucleotide). In questo caso ci sono delle interazioni intra-strand che non dovrebbero esserci. La formazione di un dimero fra queste basi distorce la doppia elica. In questo caso si osserva che non vi è difficoltà di appaiamento tra i due tra i due filamenti, ma vi è la creazione di un legame che non dovrebbe sussistere e che comporta la struttura della doppia elica.
Come si risolve?
-Interviene una nucleasi che riconosce l’ingombro sterico a carico di uno dei due filamenti E anziché andare agire Soltanto sulle basi che hanno creato quel legame non previsto, rimuove circa 12-13 nucleotidi intorno al dimero.
-siccome vengono tolte dodici basi, la sequenza a singolo filamento tenderà A richiudersi O comunque cercare di trovare dei ponti di idrogeno stabili, Dunque interviene l’elicasi, per prevenire la formazione di strutture secondarie che ripiegherebbero la struttura su se stessa e impedirebbero alla DNA polimerasi di rinchiudere il GAP
-il frammento di dodici nucloatidi e degradato molto rapidamente
-la DNA polimerasi e la DNA ligasi richiudono il GAP che si è creato ri sintetizzando da zero la sequenza di 12-13 nucleotidi che erano creati eliminato.
Come si riconosce la porzione di DNA danneggiata? il dimero di DNA si forma solo su uno dei due filamenti e non su entrambi. la struttura dell’elica Infatti dovuta alla struttura di uno solo dei due filamenti.
SISTEMI DI RIPARAZIONE DNA-danni più gravi- mismatch repair
il Mismatch repair è una situazione intermedia tra il Ber e il Ner, in cui si è un appaiamento errato Di Basi. il meccanismo è simile a quello del ner ma è più complesso poiché bisogna prima individuare qual è il filamento di nuova sintesi che presenta l’errore cosicché la cellula possa rimuoverlo e correggerlo.
Come si capisce qual è il filamento da correggere? il DNA di nuova sintesi non è ancora metilato mentre quello vecchio lo è.
il sistema del mismatch reperti si basa su tre proteine diverse
Mut S : subunità che riconosce l’errore
mut L due punti enzima che fa sì che le altre due subunità si incontrino
mut H : subunità che sa distinguere i due filamenti, quello parentale e quello di nuova sintesi.
le metilazioni sono normalmente a carico delle GpC Island. Infatti per regolare l’epigenetica sono normalmente guanine e citosine ad essere metilate. Possono essere metilate però anche le adenine, ma meno frequentemente, e proprio su questo si basa il sistema mismatch Repair.
come si individua il missmatch ?
Il macroenzima si complessa e interagisce col DNA. In particolare si complessano i due mute s e mute l che si legano al dna inserendosi nel punto in cui il mut S riconosce il mismatch, quindi una appaiamento erroneo
il mut h andrà a localizzarsi su tutte le timine in corrispondenza delle adenine metilate, quindi sul filamento nuovo, quello non metilato
a questo punto il mut S avrà riconosciuto un mismatch. E insieme al mut L scorrerà lungo il DNA fino a quando non troverai il mut h legato sul filamento di nuova sintesi
quando i tre enzimi si trovano ciascuno fornirà le proprie informazioni al complesso. il mut h segnalerà quale delle due basi e da rimuovere, il mut S ed il mut L indicheranno quale nucleotide è appaiato in maniera errata.
Come si corregge il mismatch?
Quando il complesso LS incontra la subunità mut h, effettua un taglio dello stretto non metilato, a fianco alla sequenza riconosciuta sul filamento di nuova sintesi.
intervengono delle esonucleasi per rimuovere tutto il DNA che è stato esposto (clivaggio) dal muta h fino al complesso mut L-S, ovvero fino al punto in cui è stato individuato il miss match
parlando di centinaia di basi, quindi una regione abbastanza ampia, intervengono le ssbp, In modo tale da tenere disteso il filamento parentale in modo che possa sapere da stampo e possa essere utilizzato dalla DNA polimerasi e dalla DNA ligasi per richiudere il GAP
la DNA polimerasi e la DNA ligasi risentetizza il filamento che è stato degradato e correggono il mismatch.
ROTTURE DEL DNA
Nei danni seri del DNA rientrano:
le single Strand break Repair, Ovvero le rotture a singolo filamento
le Double Strand break Repair, Ovvero le rotture a doppio filamento punto
la cellula ha due modi di reagire:
- La ricombinazione omologa, HR, Homologous recombination, che è la più Fedele
- e le ending joints Nhej, da non homologous Ending Joints
ROTTURE DEL DNA- come reagisce la cellula
DOUBLE-STRAND BREAK REPAIR
I sistemi di riparazione del Double strand non potrebbero funzionare se non si avessero due copie per ogni cromosoma. infatti nel momento in cui si crea una rottura e non c’è dall’altra parte un qualcosa a cui si possa fare riferimento, questo break si potrebbe riappiccicare con qualsiasi altro break presente sulla cellula. si creerebbero quindi cromosomi ibridi, un esempio ne è il cromosoma Philadelphia, cromosoma 9 e 22 che si rompono e si scambiano dei pezzi. ciò è dovuto al fatto che quando la doppia elica si spezza, non si ha un riferimento e quindi non homologous ending joints potrebbero agganciare qualsiasi doubles strand che si trova.
la ricombinazione omologa è considerata il sistema più fedele, In cui si può contare sulla seconda copia del cromosoma preso in considerazione. all’interno di questo sistema troviamo BRC A1 e BRC A2, i geni principali che si occupano di effettuare la riparazione del DNA tramite combinazione omologa. se vi sono delle mutazioni a carico di questi geni la cellula non è però in grado di riparare in maniera corretta il DNA in seguito al Double Strand break, e sì creano tumori e eredo-familiari ad ovaie e mammella
brca1 normalmente fa parte di un complesso proteico che chiameremo complesso di riparazione della ricombinazione omologa.
dal punto di vista enzimatico geni brca sono delle ricombinasi.
una ricombinasi nella cellula è di norma in grado di scambiare materiale genetico da una sequenza all’altra. Vengono infatti utilizzati in laboratorio e anche in alcuni processi di terapia genica perché permettono lo scambio omologo di materiale fra due cromosomi. nel caso in cui Infatti ci fosse un cromosoma che porta una mutazione, si potrebbe scambiare il materiale genetico (in modo simile al Crossing over). Si usa quindi l’altro cromatidio fratello come stampo per richiudere la rottura
Come avviene il processo di riparazione?
- È stato causato un doppio taglio sul DNA, per prima cosa va protetta l’esposizione delle estremità: il gene brca, si lega a una delle due estremità insieme al suo entourage di riparazione, composto da proteine
- In genere il taglio è netto, ed è detto Blunt ma per agevolare l’attività degli enzimi senza inserire dei primer, il sistema deve creare delle sticky ends, ovvero delle aree a singolo filamento, che ricordano un primer a cui la polimerasi si può attaccare. Bisogna ricordare che nessuna informazione viene persa durante questo processo, serve semplicemente come invito alla machinery enzimatica
- normalmente il sistema si appaia a una delle doppie estremità del break e genera dei tagli sull’altra parte della molecola che è stata tagliata, per poter agganciare la machinery
- qui entra in gioco il cromatidio fratello: si crea una struttura detta a d-loop. il suo cromatidio fratello viene allineato al cromatide che ha subito la frattura, attraverso i bracci di omologia. Il sistema di riparazione crea il d-loop e, spalancato in cromatidio fratello, fa sì che possa intervenire il sistema di polimerizzazione del DNA, utilizzando il cromatidio fratello come stampo per la sintesi di uno dei due filamenti mancanti
- il filamento neo sintetizzato dal cromatidio fratello viene usato come stampo per il secondo filamento. in laboratorio invece viene utilizzato per scambiare informazioni e far riparazioni a carico delle proteine sfruttando i bracci di omologia.
non homologous ending joints
Questo metodo viene utilizzato in casi di emergenza, quando i cromatidi Fratelli non sono disponibili, per esempio quando la cromatina non è ancora condensata. in questo caso quando si creano danni al double-strand, non abbiamo un templato disponibile: il DNA si è rotto e l’unico obiettivo è richiuderlo.
Come si richiude? la cellula lo richiude in maniera diretta: interviene la brca1, complesso differente da quello utilizzato nella ricombinazione omologa, riconoscere due estremità, le giuste appone e le richiude tramite ligasi
Se però dal Double Strand break si sono perse delle basi, o siccome c’erano le sticky ends si è attaccata alla polimerasi ne inserita alcuna in più, nel risultato del non homologus ending joins ci possono essere delle mutazioni sia da delezione che da inserzione.
Questo è quindi un meccanismo utilizzato in emergenza, che ha un enorme limite, non garantisce infatti alla cellula la fedeltà di riparazione del DNA nuova alla cellula può essere sia disfunzionale che funzionale contrarre una mutazione. In ogni caso questi sistemi sono rivolti a ridurre al minimo la perpetuazione delle mutazioni stesse.
Non vi sono soltanto questi meccanismi per ridurre le mutazioni della cellula, ma c’è tutta un’altra serie di checkpoint che possono essere attivati (un esempio è la proteina p53, detta anche Gate Keeper o guardiano del genoma, che di solito controlla che il DNA sia a posto prima di procedere nel ciclo cellulare).
La contrazione di una mutazione può avere degli effetti deleteri, come nel caso dell’Anemia falciforme punto qui la singola mutazione di un nucleotide cambia il livello del gene della beta globina, un aminoacido che codifica proprio per quella proteina strutturale del globulo rosso punto a causa di questo singolo aminoacido, i globuli rossi perdono di funzionalità e dell’originale a forma di schietto biconcavo assumendone una a falce.
il fatto che una singola base sia stata inserita in modo sbagliato, al momento sbagliato, suggerire sbagliato, può essere completamente silente o può dare origine a mutazioni pericolose.
DEPURINAZIONE BASI
La depurinazione colpisce le purine, ed è un meccanismo attraverso cui si ha l’eliminazione di una adenina o di una guanina dal DNA. in questo caso Può accadere che venga rimossa la base dal nucleotide, lasciando solamente lo zucchero e il gruppo fosfato punto A questo punto non avendo più una base corretta il voto potrebbe essere riempito da qualunque base, anche un’errata. Avendo un vuoto le cellule che proveranno dal filamento di DNA Sul quale non è stata persa una base, non riporteranno all’interno del loro codice genetico alcuna mutazione. Al contrario le cellule provenienti dal filamento che ha perso una base tenderanno a perdere delle frammento di DNA, in quanto il gioco è venuto si è formare si ripiegherà A Forcina su se stesso e verrà rimosso. Queste direzioni possono avere effetti devastanti, in quanto il codice genetico di lettura del DNA funzionerà triplette, e l’aggiunta o l’eliminazione di una base può portare ad un codone di stop o ad una mutazione missenso, che cambia l’aminoacido stesso.
DEAMMINAZIONE BASI
Nel caso della deaminazione, viene rimosso un gruppo amminico( -nh2). Se è rimosso dalla citosina il risultato è importante, in quanto, come già visto, ci porta la formazione dal posto dell’uracile dalla citosina. Questo cambiamento porta ad un errato appaiamento delle basi in quanto la citosina avrebbe dovuto legare una guanina, mentre l’uracile si legherà con una adenina. Si andrà incontro ad una mutazione puntiforme, voluta dal sistema il quale andrà ad appaiare le basi a seconda della stabilità dei legami. Se la deaminazione avviene a carico dell’adenina, la situazione è ancora peggiore, in quanto si passa ad una base chiamata ipoxantina, che normalmente non è presente, o presente in minor quantità rispetto al nostro DNA. Tale base, però, è sufficientemente specifica da legare la guanina. Ci troviamo di nuovo di fronte a una mutazione puntiforme in quanto, al posto della guaina, avremmo dovuto trovare una timina.
Quando la molecola di DNA Procede alla duplicazione avremo un filamento sano, dove non sono avvenute mutazioni, che porterà alla formazione di una molecola di DNA senza errori, e un filamento con una base mutata, che quindi porterà ad una molecola di DNA nella quale è presente una mutazione punto in questo caso la mutazione verrà poi ripetuta nelle varie duplicazioni successive del DNA in quanto un errore è presente su entrambi i filamenti.
TELOMERI
i telomeri sono le forze terminali dei cromosomi. Normalmente queste sequenze non sono codificanti, fanno Infatti parte del “Junk DNA”. Sono sequenze ricche di guaina.
Nel corso dell’esistenza si verifica il fenomeno di accorciamento dei telomeri: essi infatti sono ritenuti degli orologi biologici per la cellula. Se una cellula ha dei telomeri di una certa lunghezza, man mano che questa cellula si divide, i telomeri avranno lunghezza sempre minore. Un enzima che contrasta questo accorciamento è detto telomerasi, che però si esprime sempre meno durante il corso della vita (interviene solo fino a un certo, poi si attiva e non c’è più modo di farlo esprimere) .
La telomerasi è molto utile in laboratorio, perché quando ci sono linee cellulari che sarebbero destinate alla morte, si fa riesprimere in maniera sintetica e queste cellule acquistano un potenziale di proliferazione infinito.
TELOMERI- come fa la telomerasi a contrastare il “difetto” della polimerasi?
La telomerasi contrasta l’incapacità della polimerasi di funzionare in direzione 3’5’. Infatti la polimerasi è sempre bisogno di un primer per poter iniziare la replicazione del DNA in cinque primo Tre primo.
Mentre su un filamento la polimerasi riuscirà ad arrivare fino in fondo, su quello opposto inizierà a funzionare dal primo primer disponibile, che normalmente, non è mai all’inizio dell’estremità. Le sequenze che sporgono e che rimarranno a singolo filamento alla fine del processo di replicazione, verranno eliminate dalle nucleasi che riconoscono il singolo filamento punto per questo i telomeri man mano si accorciano. Tutte le cellule che erediteranno il filamento più corto avranno un pezzo in meno rispetto alle cellule che erediteranno il filamento antiparallelo”
La telomerasi è una sorta di DNA polimerasi che però aggiunge sequenze fisse di basi.
Come funziona la telomerasi? Ha anche lei un sito simile a quello della polimerasi che però contiene già un primer.
- la telomerasi si aggancia al singolo filamento
- ha già al suo interno uno stampo
- aggiunge molte ripetizioni della sequenza fissa basandosi sull’appaiamento di basi, mentre scorre lungo il telomero
- la parte mancante viene riempita dalla polimerasi
Se durante la replicazione vengono perdute le sequenze aggiunte dalla telomerasi, la cellula non ne risente da un punto di vista funzionale.
