Réplication ADN Flashcards
Quels sont les 2 substrats principaux nécessaire à la synthèse de l’ADN?
- dATP, DCTP, CGTP, CTTP
- un amorce
À quoi sert la matrice d’ADN?
sert à spécifier quels nucléotides doivent être ajoutés
La synthèse s’effectue par l’extension de l’extrémité ____ d’une amorce. Pourquoi?
3’ , car plus riche en énergie (si complémentarité formation d’une liaison phosphodiester ce qui libère un dimère de phosphate, ce qui n’est pas possible par l’extrémité 5’)
Rôle de l’ADN polymérase?
catalyse la synthèse de l’ADN
vrai ou faux l’ADN polymérase peut seulement ajouter quelques dNTPs
faux, les 4
vrai ou faux la géométrie de A:T et C:G est presque identique
vrai (1,08 nm de distance)
À quoi ressemble l’ADN polymérase
main droite
Comment se fait la vérification de la formation correct des paires de bases par l’ADN polymérase? si bon positionnement?
- positionnement optimum de 3’ OH de l’amorce
- bon positionnement de l’alpha phosphate (1 phosphate) du dNTP
si bon positionnement: liaison covalente alors qu mauvais = éloignement
Qu’est-ce qui va être relâché au cours de l’additionnent de paires de bases?
2 derniers phosphate : beta et gamma si :
- positionnement optimum de 3’ OH de l’amorce
- bon positionnement de l’alpha phosphate (1 phosphate) du dNTP
Lors de la vérification de la formation correct des paires de bases par l’ADN polymérase que se passent-ils s’il y a un mauvais apparemment de bases?
positionnement non favorable donc baisse drastique du taus d’ajout des nucléotides (10 000 plus lent)
vrai ou faux il est impossible d’y avoir liaison covalente entre le OH de l’amorce et le phosphate alpha s’il y a mauvais apparemment de base
faux, possible mais très peu probable
Décrire l’expérience d’incorporation pour mesurer l’activité de l’ADN polymérase
- utilisation de dNTP radioactifs ou fluorescents (environ 1 sur 4 est marqué)
- séparation des brins d’ADN er des dNTP par filtration ou électrophorèse (filtre les nucléotides non-utilisé donc filtre garde les grosse molécules)
- mesure du signal à différents temps (si beaucoup de radioactivité = plus de coups dans le temps = grande action de la polymérase)
Décrire l’expérience d’incorporation pour mesurer l’activité de l’ADN polymérase à quoi se lie le dNTP radioactif vs le dNTP fluorescent ?
dNTP radioactif : alpha phosphate (pas gamma et pas bêta, car alpha est celui qui reste no matter what)
dNTP fluorescent: remplacement d’un groupement méthyle (non impliqué dans le pairage des bases)
Que se passe-t-il lorsque des rNTP se retrouve dans le site de liaison des nucléotides (habituellement la polymérase n’ajoute pas de ribonucléotide mais peut arriver)
encombrement stérique:
-désalignement du phosphate alpha
- pas de positionnement optimale du OH de l’amorce
donc chute drastique de la catalyse (1000 x plus lent)
Comment obtenir des ADN polymérase moins discriminateur?
en remplaçant les a.a discriminateurs par des a.a avec des chaines latérales plus courtes (ex: changer glutamate par alanine)
Quels sont les cofacteurs ioniques présent dans le domaine de la paume de l’ADN polymérase?
typiquement: mg 2+ et zn 2+
ion métallique a : diminue l’affinité de 3’ OH pour son hydrogène (favorise liaison avec phosphate alpha)
ion métallique b: coordination des charges négatives des phosphate beta et gamma
Quel est le rôle du domaine de la paume de l’ADN polymérase
ce domaine vérifie les paires de bases récemment formé par de nombreux pont H avec le sillon mineur de l’ADN nouvellement synthétiser, car un mésappariment résulterais en une baisse drastique de la vitesse de catalyse
- rôle des ions métalliques ai niveau des phosphates
vrai ou faux la liaison des pont H dans le domaine de la paume de l’ADN polymérase est spécifique
faux non-spécifique car avec sillon mineur
Quel est le rôle du domaine de doigt de l’ADN polymérase
lorsqu’un pb est bien formé = stimule la catalyse en rapprochant le nucléotide entrant avec les ions métallique (de la paume) = attachement du bon nucléotide stimule l’ouverture du domaine doigt et le déplacement de la jonction amorce = matrice d’une nouvelle paire de base et un nouveau cycle se met en branle
Où y a-t-il un courbure de l’ADN matriciel? pourquoi?
une courbure d’environ 90 degrés entre la 1ere base et la 2eme base de l’ADN matriciel, pour exposer seulement la première base après l’amorce et éviter la confusion sur quelle base de la matrice doit être associé au nucléotide
vrai ou faux la courbure de 90 degrés entre la paume et le doigt de l’ADN polymérase augmente les chances d’erreurs
faux, diminue
Que permet le domaine du pouce de l’ADN polymérase? (2)
- permet une association forte de l’ADN polymérase à son substrat
- permet de maintenir l’amorce et le site actif dans des positions correcte
vrai ou faux le domaine du pouce de l’ADN polymérase ne sert pas à la catalyse de la réaction
vrai
vrai ou faux les interactions entre le domaine du pouce de l’ADN polymérase et l’ADN sont séquences spécifiques
faux, pas séquence spécifique
le domaine du pouce de l’ADN polymérase s’associe à quoi?
l’ADN nouvellement synthétiser
quels types de liaisons entre le domaine du pouce de l’ADN polymérase et l’armature de phosphate de l’ADN
liaisons ioniques
l’ADN polymérase réplicative est une enzyme ______
processive (ajoute beaucoup de nucléotides à la suite de l’autre sans arrêter (avant dson détachement à son substrat)
l’ADN polymérase est capable d’ajouter jusqu’à combien de nucléotides/seconde au brin d’amorce
1000 nucléotides/s
Selon quoi varie le degré de processivité
l’ADN polymérase (certain ajoute quelques nucléotides:20-50 (distributive) alors que d’autres 1000- 50 000 (processive))
l’ADN polymérase distributive sert à quoi?
synthèse de l’amorce
réparation de l’ADN
quel est l’évenement limitant autant pour l’ADN polymérase distributive que l’ADN polymérase processive
ajout de la polymérase sur le brin (1 seconde) alors que l’ajout des nucléotides c’est de l’ordre du milliseconde
vrai ou faux la synthèse dépend grandement du degrés de processivité
vrai
Quel forme de mésappariment de bases azoté passe inaperçues lors de la réplication de l’ADN? pourquoi?
tautomères (forme énol et céto ET amino et imino) = car bon positionnement pour qu’il y est élongation par l’ADN polymérase
- positionnement optimum de 3’ OH de l’amorce
- bon positionnement de l’alpha phosphate (1 phosphate) du dNTP
Par quoi peut être ciblé la réplication de l’ADN? 3 modes d’actions
des agents anti-cancéraux ou anti-viraux
- inhibition de la synthèse des précurseurs de nucléotides (une fois ajouté ou associé inhibe la fonction)
- arrêt de l’élongation après l’incorporation à l’ADN (nucléotide suivant peut pas être ajouté)
- endommage l’ADN (bloque la réplication ex: inhibe la topoisomérase après qu’elle est clivé et ne peut plus recollé = bris)
quelles des trois modes d’action des agents anti-cancéraux ou anti-viraux cible davantage les cellules cancéreuse
endommage l’ADN (bloque la réplication ex: inhibe la topoisomérase après qu’elle est clivé et ne peut plus recollé = bris)
=perte de cheveux
Qu’est-ce qui permet la correction sur épreuves de l’ADN polymérase?
-ADN polymérase a un site actif ayant une activité exonucléase correctrice permettant le retrait de nucléotides incorrectement appariés à l’extrémités 3’ (exonucléase peut reculer car affinité 10x plus grande pour l’extrémité 3’)
vrai ou faux la capacité réduite de l’ADN polymérase a ajouté un nucléotide adjacent à un nucléotide mauvais : favorise le retrait de celui-ci
vrai
Décrire précisément la correction sur épreuves de l’ADN polymérase par l’exonucléase
-mauvaise pb ajouté = diminution de l’activité de synthèse car diminution de l’affinité = augmente l’activité de l’exonuclease = coupe lien phosphodiester = affinité su site actif pour l’extrémité 3’ du brin diminue = activité de l’exonucléase pour l’extrémité 3’ du brin augmente = une fois le nucléotide retiré la jonction amorce matrice se réforme permettant à la polymérase d’ajouter un nouveau nucléotide
quel est le taux moyen d’erreur de l’ADN polymérase puis par rapport à avec exonucléase? puis avec la réparation postréplicationnelle des mésappariment?
1 sur 10^5 nucléotides (quand même beaucoup)
avec exonucléase baisse à 1 sur 10^7 nucléotides
puis avec la réparation postréplicationnelle des mésappariment: 1 sur 10^10 nucléotides
Qu’est-ce que la fourche de réplication?
la séparation des brins de l’ADN = oeil de réplication et les 2 extrémités = 2 fourches de réplications
vrai ou faux les 2 nouveaux brin d’ADN sont synthétisé en même temps à chaque fourche de réplication
vrai
qu’est-ce qui complique la réplication simultané?
la position anti-parallèle = brin continu et brin discontinue (fragments d’Okazaki)
comment se déplace le brin continue?
vers la fourche
comment se déplace le brin discontinue? sa longueur chez bactéries vs eucaryotes
sens opposé de la fourche
bactérie: 1000-2000 nucléotides
eucaryotes : 100-400 nucléotides
vrai ou faux les fragments d’okazaki sont plus grand chez eucaryote
faux
bactérie: 1000-2000 nucléotides
eucaryotes : 100-400 nucléotides
De quoi est composé une amorce?
ARN
Qu’est-ce qui synthétise une amorce?
primase (une ADN polymérase spécialisé)
comment long est une amorce?
5-10 nucléotides
Combien d’amorce par brin continue?
Combien d’amorce par brin discontinue?
continue: 1
discontinue: plusieurs (1/ fragment d’Okazaki)
que permet l’amorce
reconnaissance par l’ADN polymérase pour l’ajout de dNTPs
où préfère la primase préfère unité la synthèse des amorces? exemple?
à un trimère particulié
ex: GTA chez E coli
comment augmenter l’activité de la primase?
lorsque associé à l’hélicase
que permet l’hélicase?
sépare les brins d’ADNsb pour produire de l’ADNsb servant de matrice à la primase
que permet l’association primase/hélicase, mis appart l’augmentation de la vitesse
assure une activité de la primase seulement à la fourche de réplication
vrai ou faux l’amorce d’ARN doit être remplacé par une séquence d’ADN pour compléter la réplication le l’ADN
vrai
de quoi est composé RnaseH?
hybride ARN:ADN
Quel est la limite de l’RnaseH? solution?
peut seulement dégrader dégrader l’amorce d’ARN entre les rNTPs (peut seulement cliver ces liens là)
solution: L’exonucléase vient cliver les liens lien entre dNTP et rNTP
suite à l’excision des des rNTPs par RnaseH et de lui rNTP-dNTPs par exonucléase il y a________
polymérisation en utilisant de l’ATP pour créer une liaison phosphodiester entre le 5’ phosphate et le 3’OH adjacent , puis la ligase vient lier
L’ADN hélicases est une enzyme processive ou distributive? polarité?
processive : polarité soit 5’-3’ ou 3’-5’
quelle est la polarité de L’ADN hélicases sur le brin continue?
3’-5’ (sur brin matrice)
quelle est la polarité de L’ADN hélicases sur le brin discontinue?
5’-3’ (sur brin matrice)
comment est composé L’ADN hélicases?
un hexamère formé de 6 s-u avec un canal central entourant l’ADNsb (association des boucles en épingle à cheveux des différentes s-u de l’hélicase avec des groupement phosphates des nucléotides)
que doit utilisé l’hélicase pour être fonctionnel?
ATP
qu’est-ce qui permet l’ouverture de la double hélice
hélicase
combien de brins passe par le canal central de l’hélicase. Pourquoi?
1, car le diamètre du canal central est de 13A alors que le diamètre de l’ADNdb est de 20A (passe pas)
que permet le tirage de l’ADNsb dans le canal central
une succession de changement de conformation des s-u de l’hélicase
par quoi est stabilisé l’ADNsb?
protéines SSB
quand les protéines SSB s’attache à l’ADN?
après le passage de l’hélicase = ADNsb
pour empêcher la formation de paires de bases avant que l’ADN pol arrive et l’utilise comme matrice au brin complémentaire ou à l’ARN primase pour la synthèse d’une force
qu’est-ce qui permet de limiter l’apparition de structures secondaire sur de l’ADNsb et de limiter d’avoir trop d’ADNsb?
protéines SSB
quel type de liaison particulière à les protéines SSB avec l’ADNsb? favorise quoi?
liaison coopérative / liaison ionique
-liaison d’une protéine ssb favorise liaison d’une autre directement à côté
vrai ou faux l’association des protéines SSB avec l’ADNsb est séquence-indépendante
vrai
vrai ou faux l’association des protéines SSB avec l’ADNsb se fait majoritairement avec des pont H
faux avec des liaisons électrostatique/ionique
qu’est-ce qui masque les b.a pour pas qu’elles fassent de pont H avec des protéines spécifique de l’ADNsb
protéines SSB
qu’est-ce qui fait le retrait des super tours positifs causé par le déroulement de l’ADN
topoisomérase
que se produit-il qui empêche la séparation des brins d’ADN suite au passage de l’hélicase. solution?
l’augmentation du Lk
1 Lk doit être retiré à chaque 10 pb d’ADN déroulé par la topoisomérase
que permet les topoisomérase 1 et 2
maintient ADN dans un état relaxé en coupant 1 ou 2 brins d’ADN, pour diminuer le Lk avant de ressouder les brins
vrai ou faux tous les enzymes de la fourche de réplication se lient à l’ADN de façon séquence-dépendante
faux, séquence indépendante
Quelles sont les 4 méthodes de liaison possible des enzymes de la fourche de réplication à l’ADN
tous de façon séquence indépendante :
- charges négatives des groupements phosphate (pouce ADN pol)
- pont H dans sillon mineur (paume ADN pol)
- empilement d’interactions hydrophobes avec les bases (protéines SSB)
- encercle l’ADN (ADN hélices, ADN pol (partiellement)
Comment se nomme l’ensemble des protéines fonctionnant à la fourche de réplication. qui en fait parti?
réplisome: primase, ADN hélicase, SSB, topoisomérase
vrai ou faux il y a spécialisation de l’ADN polymérase
vrai
Nommez les différents polymérase dans la cellule E coli et leur rôle
polymérase 1 : retire les amorces d’ARN
polymérase 3 : enzyme principale de la réplication de l’ADN
polymérase 2, 4, 5: réparation de l’ADN
entre polymérase 3 et polymérase 1 chez E coli qui a une processivité élevé?
polymérase 3
vrai ou faux polymérase 3 et polymérase 1 chez E coli font de la réparation sur épreuve
vrai
entre polymérase 3 et polymérase 1 chez E coli qui a une activité 5’ exonucléase?
polymérase 1
entre polymérase 3 et polymérase 1 chez E coli qui peut retirer le lien ARN-ADN résistant à RnaseH?
polymérase 1
Nommez les différents polymérase dans la cellule eucaryotes et leur rôle
souvent plus de 15 ADN polymérase différente dont :
ADN pol alpha: synthèse amorce et réparation
ADN pol beta: réparation
ADN pol petite bombe: proccessivité pour la synthèse brin discontinue
ADN appartient: réparation et rôle dans l’hélicase, synthèse brin continue
ADN gamma: mitochondrie réparation et synthèse
dans e coli ou eucaryote qui a du polymerase switching?nommez un exemple
eucaryote: ADN pol alpha est constitué de 2 s-u primase et 2-su pol alpha, donc faiblement processive = synthétise amorce et commence synthèse puis se détache et remplacé par l’ADN pol petite bombe sur le brin discontinu et par l’ADN pol appartient sur le brin continue
par qui est effectué la synthèse sur le brin continue vs discontinue?
ADN pol petite bombe: proccessivité pour la synthèse brin discontinue
ADN appartient: réparation et rôle dans l’hélicase, synthèse brin continue
quel est la différence structurelle entre l’ADN pol alpha et l’ADN pol petite bombe/appartient
ADN pol alpha : seule et constitué de 2 s-u primase et 2-su pol alpha, donc faiblement processive
alors que ADN pol petite bombe/appartient: a un anneau coulissant permettant une grande processivité (élongation)
comment est constitué une protéine à pince coulissante?
un trimère de PCNA
rôle de protéine à pince coulissante?
responsable d ela processivité de l’ADN pol permet de synthétiser plus que 20-100 pb (sans protéine coulissante) , maintenant peut synthétiser des milliers voir millions de paires de bases avant de se détacher
qu’est-ce qui permet le glissement des protéine à pince coulissante?
beaucoup d’espace, diminue friction (dans toutes les espèces)
comment se nomme la protéine à pince coulissante?
complexe annulaire
vrai ou faux les protéine à pince coulissante stabilise l’ADN polymérase par la formation d’un complexe annulaire
vrai
Quand est-ce que le complexe protéine à pince coulissante et ADN polymérase a une grande affinité pour l’ADN? quand non? qu’est-ce qui se passe?
tant que tu es entre des amorces, quand rencontre rNTPs baisse d’affinité de ADN polymérase pour protéine à pince coulissante , alors se décroche (grâce à un changement de conformation)
vrai ou faux l’ATP est nécessaire au chargement sur l’ADN des anneaux coulissant?
vrai
Décrire la pose des anneaux coulissant sur l’ADN
- le poseur d’anneaux coulissant s’associe à l’ATP (augmente affinité pour l’anneau), ce qui permet de s’associer à un complexe annulaire (anneaux) et ouverture de celui-ci (anneau) : ADN insérer au centre de l’anneau
- hydrolyse de l’atp = relâchement de l’anneau (complexe annulaire) par le poseur d’anneau et fermeture de l’ anneau autour de l’ADN
Décrire le retrait des anneaux coulissant sur l’ADN
même protéine que lors de la pose= e poseur d’anneaux coulissant, mais nécessite pas d’ATP
vrai ou faux la pose et le retrait des anneaux coulissant sur l’ADN nécessite de l’ATP
faux seulement la pose
Qu’est-ce qui empêche la liaison en même temps de l’ADN pol et le poseur d’anneau?
ils ont des sites de liaison qui se chevauchent alors il ne peuvent s’y lier en même temps
Qu’est-ce qu’un holoenzyme?exemple?
un holoenzyme est un complexe protéique avec une activité enzymatique principale qui est associé à des composantes additionnelles améliorant sa fonction.
exemple: holoenzyme ADN polymerase 3 de E Coli. : 4 enzyme: 3 ADN polymerase 3 et 1 protéine de chargement des anneaux coulissant + 3 protéines tho qui rejoigne les poly à la protéine coulissante
chez E coli combien de polymérase 3 sont utilisés lors de la réplication? combien brin continue et discontinue?
3 ADN polymérase (de l’holoenzyme)
1 sur continue
2 sur discontinue
chez E coli combien d’hélicases joue lors de la réplication? combien sur brin continue et discontinue? voyage 5’ à 3’ ou 3’ a 5’ ?
1 sur brin discontinue 5’ a 3’ (sur brin matrice = brin matrice toujours par défaut)
chez E coli est-ce que l’hélicase se lie à la primase?
oui liaison faible ce qui augmente son activité de synthèse d’amorce par 1000x
chez E coli l’anneau coulissant est chargé avant ou après la synthèse de l’amorce? quiets-ce qui vient se joindre ensuite?
après la synthèse de l’amorce, 1 ADN pol viens s’associer pour synthètiser l’ADN
chez E coli, l’activité de l’hélicase est augmenté par son association avec?
l’ADN polymérase 3
chez E coli, que cause la dissociation de l’ADN hélicases et de l’ADN pol 3 ? permet quoi?
une diminution de l’activité de l’hélicase d’un facteur de 10x (lorsque les 2 sont associés ils travaillent au même rythme, mais si dissocié ADN pol 3 réplique l’ADN plus rapidement que l’hélicase peut séparer les brins)
permet à pol 3 de rattraper le retard qu’il aurait pu prendre sur l’hélicase (par exemple lors de réparation)
quel est le risque d’avoir une activité trop importante de l’hélicase? solution?
- trop de simple brin (formation de structure secondaire ou se mêle)
solution: oui SSB mais pas solution magique, sinon dissociation d’avec l’ADN pol 3
qu’est-ce qu’un réplicon?
toute l’ADN répliqué à partir d’un origine de réplication
qu’est-ce qu’un origine de réplication?
site spécifique où les brins d’ADN sont séparés pour permettre l’assemblage de la machinerie de la réplication qui initie la réplication
nombre d’origines de réplication chez eucaryote vs bactéries?
eucaryotes: des milliers
bactéries: 1 seul (souvent)
L’origine de réplication est contrôler par 2 éléments?
- réplicateur
- initiateur
Combien de réplicon/origine de réplication? combien bactérie combien eucaryote?
1 réplicon/origine de réplication
eucaryotes: des milliers
bactéries: 1 seul (souvent)
vrai ou faux le réplicateur et l’origine de réplication se chevauche toujours
vrai
qu’est-ce qu’un réplicateur?
séquence d’ADN suffisante pour diriger l’initiation de la réplication (sur l’ADN)
qu’est-ce qu’un initiateur?
protéine reconnaissant spécifiquement un élément de l’ADN dans le réplicateur et active l’initiation de la réplication.
qu’est-ce qui détermine le site qui deviendra l’origine de réplication?
initiateur
Nommez les 3 réplicateurs bien connus chez E coli
- en vert : sites de liaisons de l’initiateur (9 mer)
- en bleu: sites initiaux de la formation de l’ADNsb (13 mer)
- en rouge: site de la synthèse initiale de l’ADN
De quoi est composé les réplicateur de E coli. quel est son nom?
réplicateur = OriC : 3x 13 mer (en bleu) et 4x 9mer (en vert)
vrai ou faux l’origine de réplication n’est qu’une petite partie du réplicateur (soit la partie où l’initiateur c’est lié au réplicateur)
vrai **
vrai ou faux les réplicateurs eucaryotes multicellulaires sont bien connus
faux
vrai ou faux les réplicateurs eucaryotes sont plus long que bactéries
vrai (>1000 pb)
comment caractériser les réplicateurs des cellules eucaryotes multicellulaires?
aucune séquence spécifique, critère pour être réplicateurs:
- densité réduite en nucléosome
- la transcription dans le voisinage
Décrie expérience d’identification des origines de la réplication et des réplicateurs chez la levure (un exemple)
ADN isolé avec enzyme de restriction, les fragments d’ADN cloné sont introduits dans des plasmides qui n’ont pas d’origine de réplication mais qui ont un marqueur sélectionné (ex: résistance à un antibiotique), des hôtes (dans ce cas levures) sont transferts avec ce plasmide. Pour que le plasmide soit transmis à la descendance il doit y avoir un réplicatuer dans son insert d’ADN (donc ADN ajouté au début contient un réplicateur)
vrai ou faux l’ADN en cours de réplication est linéaire
faux, oeil de réplication
Lorsque nous clivons un fragments d’ADN celui-ci peut contenir ou non une origine de réplication. Si contient un origine de réplication et on coupe immédiatement après l’initiation de la réplication à quoi ressemble le fragment?
une forme de bulle
Lorsque nous clivons un fragments d’ADN celui-ci peut contenir ou non une origine de réplication. Si contient un origine de réplication symétriquement disposé dans le fragment et on coupe immédiatement après l’initiation de la réplication à quoi ressemble le fragment?
départ ressemble à une bulle puis va prendre forme de Y (quand se propage)
Lorsque nous clivons un fragments d’ADN celui-ci peut contenir ou non une origine de réplication. Si contient pas d’origine de réplication, mais qu’il est en cours de réplication à quoi ressemble le fragment?
forme de Y
Décrire une méthode afin d’observer les structures inhabituelles de l’ADN en cours de réplication
séparation sur gel 1D ou sur gel 2D
gel 1D: séparation à vitesse plus faible, selon la taille (gel d’agarose à plus petite concentration)
gel 2D: séparation à vitesse plus élevé, selon la forme et la taille (gel d’agarose plus concentré)
Si j’ai 3 fragments différents d’ADN qui subissent une réplication dans quel ordre je vais les voir sur le gel 1D et 2D:
- petite bulle
- grosse bulle
- vrm gros Y
1D: moins loins -vrm gros Y -grosse bulle -petite bulle plus loins
2D: moins loins -grosse bulle -vrm gros Y -petite bulle
Comment est-ce possible de réguler la réplication chez E coli?
par SeqA et le niveau d’AdnA-ATP
Expliquer l’inhibition de la ré-initiation rapide de la réplication de l’ADN chez E coli par SeqA et le niveau d’AdnA-ATP en détail
ADN de E coli est méthylé aux séquences GATC par la Dam méthyltransférase, une fois répliqué l’ADN est hémiméthylé aux sites GATC ce qui est un site de reconnaissance par SeqA = empêche la méthylation complète de ces sites par la dam méthylase et empêche aussi la liaison à OriC de l’AdnA-ATP = empêche la réplication, seulement le temps va permettre la réinitiation car AdnA-ATP va éventuellement hydrolyser son ATP, mais seulement en présence de Hda-ADP (une protéine apporté par un anneau coulissant sur l’ADN (en absence de pol 3)), par contre le processus d’échange ATP/ADP est lent donc AdnA reste inactivé pendant un certain temps.
vrai ou faux, il y a des sites de liaisons à l’AdnA à l’extérieur des OriC de E coli
vrai >300 sites de liaisons qui servent à réguler la transcription de gènes. Lors de la réplication on double le nombre de sites ce qui a pour effet de diminuer le nombre d’AdnA disponible pour la réplication (inhibition de la ré-initiation rapide de la réplication de l’ADN chez E coli )
Qu’est-ce que l’ADNa ?
l’initiateur chez E coli
Qu’est-ce que ORIC?
le réplicateur chez E coli
Que se passe-t-il en croissance rapide chez E coli?temps?
l’origine de réplication ré-initie la réplication avant la division cellulaire :
croissance rapide E coli prend 20 min pour se diviser alors que la réplication prend 40 min. (prend avance sur la prochaine génération : pourrait y avoir initiation OriC indépendante)
Décrire le modèle de l’initiation de la réplication chez E coli
réplicateur (9mer), l’initiateur (AdnA-ATP) vient se mettre le réplicateur = origine de réplication, causant une courbure dans l’ADN (séparation plus facile pour l’hélicase), le complexe hélicase et hélicase loader vient se placer proche de l’initiateur sur le brin discontinue (1 à chaque fourche de réplication), la primase vient s’installer sur chaque hélicase (donc 2 hélicase, 2 primase = 1 à chaque fourche de réplication), lorsque la primase s’installe on perd l’hélicase loader, 2 holoenzyme de polymérase 3 vient s’installer (1 à chaque fourche de réplication), des anneaux coulissants viennent s’installer pour les polymérase 6 aux total : 3 par fourche de réplication), la syhtèse commence avec (2 polymérase 3 sur le brin discontinue et 1 polymérase sur le brin continue) x 2 car dans chaque fourche de réplication : il y a repliement en petite bosse du brin discontinue des deux côtés
Combien de fois par cycle cellulaire les chromosomes eucaryotes doivent être répliquées? pourquoi?
1 seule fois:
- car sinon si pas complet: bris des chromosomes lors de la ségrégation
- (si + ou - de réplication) = lésions difficile à réparer (souvent amplification de l’ADN associé augmente l’expression des gènes associés de manière inapproprié menant à expression de mauvais gènes, division cellulaire et signaux de l’environnement)
contrairement aux bactéries lors de la réplication eucaryote les réplicateurs sont inactivés. Pourquoi? comment inactivé?
car chromosomes humains ont des milliers de OriC donc il faut contrôler pour par ré-initier la réplication, mais grader suffisamment d’origines activés pour assurer la réplication complète lors de la phase S
-inactivé en retirant les hélicases chargés des Origine de réplication
Qu’est-ce que Mcm2-7
dimère d’hélices chargé mais non activé
quand est-ce que mcm2-7 est chargé?
lors de G1
quand est-ce que mcm2-7 est activé?
lors de la phase S (activation du réplisome + hélicase)
Nommez les 4 protéines nécessaire à la pose de l’hélicase sur ADN (lors de G1)
- ORC-ATP (initiateur eucaryote qui reconnait le réplicateur)
- Cdc6-ATP et Cdt1 (2 protéines de chargement de l’hélicase recruté par ORC-ATP)
- 2 copies de l’hélicase installés tête à tête pour formé un dimère mcm2-7
Nommez l’initiateur eucaryote et E coli
eucaryte: ORC-ATP
e coli: AdnA
Décrire étape par étape le chargement de l’hélicase
ORC-ATP (initiateur) va sur le réplicateur, Cdc6-ATP se lie au réplicateur par ORC-ATP, 2x(Cdt1-hélicase) se lie au complexe Cdc6-ATP/ORC-ATP : hydrolyse de l’ATP de Cdc6 libre celui-ci et 2xCdt1, puis hydrolyse de l’ATP de ORC mène au chargement du dimère d’hélicase (mcm2-7)
ICI PAS ACTIVE SEULEMENT CHARGÉ (dimère d’hélices entour l’ADNdb)
L’hélicase mcm2-7 entour ADNsb ou ADNdb
ADNdb
Décrire étape par étape l’activation de l’hélicase
hélicase mcm2-7 présente sur ADNdb, CDK phosphoryle Sld2 et Sld3 qui s’associent à Dpb11 (qui favorise l’association de Cdc45 sur mcm2-7 et l’association de GINS sur mcm2-7), ensuite DDK phosphore Mcm2-7 pour favoriser aussi l’association de Cdc45 sur elle
Donc hélicase est activé par la formation du complexe CMG (cdc45-mcm2-7-gins) , qui recrute l’ADN pol appartient sur le brin continu ce qui mène à la séparation du dimère (éjection d’un brin ADN), après le déroulement d’une section d’ADN par l’association de pol appartient, ADN pol alpha (2s-u pol et 2 s-u primase) et petite bombe sont recruté au complexe d’initiation = oeil de réplication
quel est la majeur différence entre hélicase chargé et hélicase activé
chargé: dimère qui entour ADNdb
activé: monomère qui entour ADNsb
quand dans l’activation les hélicases du dimère mcm2-7 se séparent?
lors de la formation du complexe CMG
Dans quel phase il y a du chargement, mais pas d’activation de l’hélicase, pourquoi?
phase G1, niveau bas de CDK donc peut pas phosphoré Sld2 et Sld3 pour ensuite associé Dpb11 etc., donc pas de possibilité de formation de 2 monomère reste sous forme mcm2-7! Le CDK inhibe le chargement donc on en veut pas
Quel est le rôle majeur de CDK et comment fait-il?
inhibe le chargement:
- phosphorylant Orc2 et Orc6 (bloque 1 site de liaison de Ctdt1 de Orc6 = pas suffisant pour le chargement)
- phosphorylant Cdc6 (engendre sa dégradation, donc peut pas chargé puisque 1 des premières étapes)
- phosphorylant mcm2-7 (directement diminue la concentration de l’hélicase en exportant mcm2-7 soluble dans le cytoplasme)
- association avec s-u de Orc6 = encombrement stérique qui diminue le recrutement de Ctd-1-Mcm2-7
Dans quel phase il y a de l’activation, mais pas de chargement de l’hélicase, pourquoi?
Phase S, G2, M (on active ceux déjà chargé mais on charge pas de nouveau)
niveau de CDK élevé : inhibe le chargement
-phosphorylant Orc2 et Orc6 (bloque 1 site de liaison de Ctdt1 de Orc6 = pas suffisant pour le chargement)
-phosphorylant Cdc6 (engendre sa dégradation, donc peut pas chargé puisque 1 des premières étapes)
-phosphorylant mcm2-7 (directement diminue la concentration de l’hélicase en exportant mcm2-7 soluble dans le cytoplasme)
-association avec s-u de Orc6 = encombrement stérique qui diminue le recrutement de Ctd-1-Mcm2-7
Qu’est-ce qui permet de réguler s’il y a activation ou chargement de l’hélicase?
concentration de CDK
nous savons que l’ADN circulaire doit être décaténé par la topoisomérase 2 suite à la réplication, mais est-ce aussi le cas pour l’ADN linéaire?
oui, pour ADN linéaire eucaryote de taille importante et dû à son organisation en boucle attaché à une armature il y aussi décaténation requise
vrai ou faux il y a un problème de réplication des extrémités de l’ADN circulaire
faux pour ADN linéaire
Décrire le problème de réplication des extrémités de l’ADN linéaire
la primase n’a pas assez de place pour synthétiser une dernière amorce pour compléter la synthèse du brin discontinue alors l’amorce d’ARN est retiré sans pouvoir être remplacé par de l’ADN = raccourssissement progressif du chromosome au fil des cycles de réplication si pas de solution
vrai ou faux il y a un problème de réplication des extrémités de l’ADN linéaire juste pour le brin discontinue
vrai
Quelle est la solution du problème de réplication des extrémités de l’ADN linéaire chez les bactéries/virus
note: pour ceux qui ont un chromosome linéaire plutôt que circulaire !
utilisation d’une protéine amorce comme solution: le OH d’une tyrolien de la protéine remplace l’extrémité 3’-OH normalement fourni par l’amorce d’ARN = permet la réplication complète du chromosome
pour les bactéries plus grosse c’est combiné à l’utilisation des origines conventionnelles
Quelle est la solution du problème de réplication des extrémités de l’ADN linéaire chez les eucaryotes, et ou se situe le problème?
le télomère (fin du chromosome composé en séquence riche de TG : 5’-TTAGGG-3’, est où se site le problème, l’extrémité 3’ s’étend plus loins que la 5’ donc ADNsb)
cette ADNsb 3’ devient une origine de réplication pour l’ADN polymérase spécialisé: télomérase :
1- vient allonger encore plus l’extrémité 3’ pour créer une matrice allongé afin de permettre l’élongation des 2 brins
2-ajout d’un amorce d’ARN pas au bout bout mais au bout de l’extrémité 3’ matrice juste un peu avant
3-élongation par la télomérase afin de compléter la réplication de l’extrémité
quelle est la structure de la télomérase?
plusieurs s-u protéiques et une composante ARN (TER de 150 à 1300 bases)
est-ce que le télomère est codant
non
pourquoi la variation de longueur du dépassement de l’extrémité 3’ est bien toléré? d’où vient cette variation de longueur, pourquoi conservé?
car aucune protéine n’est encodé dans la séquence répétitive du télomère : vient du 3’ conservé en sb, agit comme protection aux extrémités du chromosome (formation de t-boucles….)
vrai ou faux plusieurs cellules ont une activité limité de la télomérase
vrai
vrai ou faux les cellules souches ont un bas niveau d’activité de la télomérase
faux haut niveau
vrai ou faux en vieillissant les télomères raccourcissent
vrai
qu’est-ce que limite la longueur des télomères
le nombre de fois que la cellule peut se diviser
qu’elle effet à l’augmentation de la télomérase
“immortaliser”
Quelle pourrait être une façon de limiter la croissance des cellule ayant perdu leurs mécanismes normaux contrôlant la croissance
jouer sur les télomère
vrai ou faux toutes les cellules cancéreuses a=ont une grande activité de télomérase
faux grande majorité mais pas toutes
Pourquoi des protéines se lient aux télomères?
- protéger les télomères
- empêcher l’élongation indéfinies de ceux-ci
Décrire précisément comment des protéines qui se lient aux télomères empêche l’élongation indéfinies de ceux-ci
1- Rif1 et Rif2 se lie à Rap1 qui se lie à l’ADNdb du télomère = inhibe la télomérase
2-Cdc13 se lie à l’ADNsb du télomère (impliqué dans le recrutement de la télomérase)
3-complexe shelterine
TRF1, TRF2 et Rap1 se lie à l’ADNdb et recrute : TIN1, TIN2 et POT1, puis POT1 se lie à l’ADNsb et inhibe la télomérase
Pourquoi on dit que les protéine protèges l’extrémité des chromosomes?
car protège de l’action des enzymes de réparation qui pourrrait confondre les extrémités pour des bris normaux d’ADN = pourrait engendrer une fusion des chromosomes et donc un bris aléatoire des chromosomes
Quel est la particularité des protéines des levures qui se lient aux chromosomes?
les protéines qui se lient aux téloméres sont des faibles inhibiteur de la télomérase, donc il doit y avoir un effet additif pour y avoir inhibition (télomérase reste alors active plus longtemps)
Quelle est la structure des télomères comment se forme-t-elle?
structure en boucle : nommé boucle-t, formé par l’invasion de l’ADNsb dans une région télomérique bicaténaire (donc masque l’extrémité du télomère= pu reconnu comme un extrémité libre
lorsqu’on est sous forme de télomère est-ce qu’il y a de l’ADNsb qui peut être reconnu?
non masqué par boucle-t
Que permet la boucle-t?
un contrôle de la longueur des télomères car la télomérase ne reconnait pas l’ADNsb sous forme de boucle-t, mais avec le raccourcissement du télomère éventuellement pourra pu faire une boucle-t alors télomérase va venir agir
Qu’est-ce qui dirige la formation de la boucle-t chez l’humain?
TRF2
Que permet TRF2?
dirige la formation de la boucle-t chez l’humain
comment le 15% des cancers qui n’utilise pas la télomérase peut quand même avoir élongation?
par la “fourche de réplication” à l’intérieur de la boucle-t
