Regulação em eucariotas superiores

Question 1

Características da transcrição em higher eucariotas, comparando com procariotas:

Answer 1

• Há mais sinais de integração: para muito genes a ativação depende da presença simultânea de muitos ativadores, sendo que cada um pode ser controlado por um sinal diferente
• Há mais control combinatório: muitos ativadores trabalham em várias combinação com outros ativadores (e repressores) para regular diferents sets de genes
• Genes são normalmente controlados po diferentes sets de reguladores: isto permite que o mesmo gene seja expresso em resposta a diferentes sets de sinais

Question 2

O que é um enhancer?

Answer 2

Um set de sítios de ligação de regulação contínuos (seguidos), que podem estar localizados muitos milhares de pares de bases upstream ou downstream dos genes (portanto, “wotk at a distance”).

Question 3

• O genoma da levedura codifica cerca de ____ fatores de transcrição.
• Genoma de C. Elegans e D. Melanogaster têm, pelo menos, ________ fatores de transcrição
• Genoma humano tem cerca de ________.

Answer 3

• 300
• 1000
• 3000
  Dados a natureza combinatorial da regulação da transcrição, estas diferentes modestas nos números pode produzir uma expansão dramática na complexidade regulatória

Question 4

O ________________ é requerido para a expressão de todos (ou quase todos) os genes que a polyII transcreve.

Answer 4

Complexo mediador

Question 5

Mecanismos de ação de repressores eucarióticos:

Answer 5

• competição: ligam-se a um local de DNA que se sobrepõe com o local de ligação de um ativador → inibição a ligação do ativador, inibindo a sua ativação;
  - proteína derivativa de um ativador, mas com perda da região de ativação
  - proteína derivativa de um ativador que só está ativo em forma de dímero, que mantém a região de dimerização mas perde a região de ligação ao DNA
• inibição: repressor liga-se ao DNA, assim como o ativador, e interage com este, ocluindo a sua região de ativação
• repressão direta: repressor liga-se upstream do gene e, interagindo com a maquinaria de transcrição no promotor, inibe a iniciação da transcrição
• repressão indireta: recrutamento de modificadores de histonas que alteram os nucleossomas de maneira a inibir a transcrição (deacetilação, metilação)

Question 6

O embrião precoce de Drosophila apresenta uma distribuição não uniforme de 4 reguladores de transcrição. Quais?

Answer 6

• Bicoid e Hunchback - vão se concnetrar na parte anterior do embrião
• Giant - vai se concnetrar em duas regiões diferentes
• Kruppel - concentra-se mais ou menos a meio

Question 7

O que é que as diferentes localizações dos 4 fatores de transcrição define?

Answer 7

A informação posicional ao longo do eixo anterio-posterior.

Question 8

Que gene regulam estes fatores de transcrição na Drosophila?

Answer 8

Gene eve, um gene importante no desenvolvimento deste embrião

Question 9

O locus de eve contém ____ kbp. Quantos enhancers?

Answer 9

• 12 kbp
• 5 enhancers
• na região 5’ (upstream) contém 2 enhancers que controlam as stripes 3, 7 e 2 e cada enhancer estende-se por 500 bp
• na região 3’ (downstream) contém 3 enhancers que controlam as stripes 1, 4, 5 e 6

Question 10

O que gera esta expressão do gene eve em riscas?

Answer 10

Ligação ou não dos diferentes fatores a locais de ligação a montante do gene (enhancer) e que são responsáveis pela definição de cada faixa.

Question 11

Como é que os 4 fatores regulam a expressão do módulo da strike 2?

Answer 11

Repressores: Kruppel e Giant
Ativadores: Bicoid e Hunchback
(o módulo para a stripe2 contém locais de ligação para os 4 fatores e transcrição)

Question 12

O que acontece à stripe 2 se as moscas não conseguirem expressar os ativadores (Bicoid e Hunchback) e os repressores (Kruppel e Giant)?

Answer 12

• Se não expressarem os ativadores, as moscas não vão conseguir formar a stripe 2 eficientemente
• Na deficiência dos dois repressores, a stripe 2 expande-se e vão cobrir uma região anormal do embrião.

Question 13

Assim, a stripe 2 é apenas expressa na região que tem ____________ e as barreiras da stripe são definidas pela expressão de:

Answer 13

• Hunchback e Bicoid
• Kruppel e Giant

Question 14

Enhancers diferentes atuam independentemente entre si na região regulatória de eve. Porquê?

Answer 14

Repressores ligados a um enhancer não interferem com ativadores em enhancer vizinhos, pois não possuem sítio de ligação para sequências de DNA específicas que lhe permite reconhecer e ligar-se aos dois enhancers. Por exemplo, o eve 3 é expresso na região de eve 2 mas não é reprimido por Kruppel porque este não se consegue ligar ao seu DNA. Por além disso, a ligação de repressores em enhancers da stripe 2 não vão interferir com enhnacers da stripe 3 dada a sua grande distância

Question 15

Em mamíferos, a forma mas comum de metilação é:

Answer 15

Transferência de um grupo metil para o C5 de um citosina

Question 16

Onde ocorre a metilação ao nível do DNA?

Answer 16

Em dinucleótidos CG (ou CpG). Atenção, não confundir com ilhas de CpG

Question 17

Cerca de ____% dos CpGs nos mamíferos estão metilados. A metilação é simétrica, o que significa que ________________________. Ocorre em zonas _____________________________.

Answer 17

• 80
• ocorre em ambas as cadeias
• zonas repetitias, regiões intergénico e no corpo do gene

Question 18

Como é que a metilação é mantida durante a replicação?

Answer 18

Numa parte onde apenas uma cadeia está metilada, a maquinaria de replicação do DNA normalmente incorpora a citosina (dCTP) disponível não metilada e, assim, é formada um replicado de DNA hemi-metilado (metilado apenas numa cadeia), sendo que a cadeia metilada é a parental (e não a recém-formada). Por fim, a propagação fiel da metilação de DNA requere a conversão de sítios hemi-metilados para novamente moléculas metiladas simetricamente.

Question 19

Que organismos perderam a maquinaria de metilação?

Answer 19

S. cerevisiae, C. elegans e Drosophila
(em mamíferos, a metilação é crucial para o seu desenvolvimento embriónico)

Question 20

Em que consiste o fenómeno de imprinting?

Answer 20

Mamíferos têm duas cópias de um gene e na maioria dos casos, são os dois expressos de forma idêntica. Nos casos de imprinting, uma cópia está ativa e outra inativa

Question 21

Sabendo que os enhancers estão a milhares de pares de bases de distância dos promotores que regulam, como é que não afetam outros promotores mais próximos?

Answer 21

Para prevenir esta ativação promíscua, existem os enhancer-blocking insulator, localizados entre um enhancer e um certo promotor, prevenindo a sua comunicação.

Question 22

Duas propriedades dos insulators:

Answer 22

• Bloquear a comunicação enhancer-promtoor, bloqueando a atividade do enhancer.
• Previnem a propagação de cromatina repressiva (funciona como barreira)

Question 23

Exemplo de um modo de ação dos insulators:

Answer 23

Mover um promotor para um loop de DNA, onde fica protegido (não consegue ser ativado) pelo enhancer.

Question 24

No imprinting materno a cópia ativa é herdada de ____________ e vice-versa.

Answer 24

Pai

Question 25

Exemplos de imprinting maternal e paternal nos ratos:

Answer 25

• Igf2 herdado pelo pai é a única cópia ativa - imprinting maternal
• H19 herdado pela mãe é a única cópia ativa - imprinting paternal

Consequência: o gene comporta-se como se só houvesse uma cópia do gene, apesar de haverem duas.

Question 26

Como ocorre imprinting nos genes Igf2 e H19?

Answer 26

Igf2 e H19 são ativados pelo mesmo enhancer.
ICR (região entre os dois gens) é metilado nas células germinativas do pai e não metilado nas células germinativas na mãe.
* ICR não metilado nas mulheres pode ligar-se a uma proteína regulatória CTCF, que atua como insulator bloqueador de enhancer, que bloqueia a a comunicação do enhancer com Igf2, bloqueando a sua transcrição.
* A metilação de ICR no homem prevente a ligação de CTCF na região, permitindo a transcrição de Igf2, mas, por outro, lado bloqueia a trancrição de H19.

Question 27

Os genes são herdados metilados ou não metilados?

Answer 27

Os genes que estejam metilados nos gâmetas, também vão ser herdados metilados.

Question 28

As células germinativas primordiais estão metiladas ou não metiladas?

Answer 28

As células germinativas primordiais são equivalentes epigeneticamente, ou seja, não têm a marca de imprinting (a metilação foi “apagada”). Mas a metilação vai ocorrer posteriormente e quando temos a formação de gâmetas completamente funcionais, temos a a propagação do impriting.

Question 29

Importância da regulação da transcrição na evolução?

Answer 29

Por vezes, a diferença no padrão de transcrição de um certo gene, em vez da evolução de novos genes, tem um papel importante e determinativo para gerar diversidade.