Aula 10 - RNAi applications Flashcards
O que é um shRNA?
short hairpin RNA - um RNA com uma sequência sense e anti-sense (complementar à sense) que depois de transcrito se dobra e forma uma estrutura de hairpin. Pode depois ser clivado pela Dicer para ser usado na RISC.
Quais os dois vetores usados mais usados para expressão de shRNA e quais as diferenças entre eles?
Vetores adenovirais: não há inserção no cromossoma, a sua expressão é transiente
Vetores lentivirais: integram no cromossoma, a sua expressão é permanente
Como podem ser usados os RNAi em terapias?
Usando siRNA que tenha como alvo genes responsáveis pela doença (silenciando-os).
Dá exemplos de doenças que são alvos promissores para o uso de RNAi
Age-related macular degeneration (AMD), infeções virais, doenças neurodegenerativas, cancros
Qual o maior obstáculo do uso de RNAi para terapias?
O sistema de delivery do RNA para os tecidos - RNA são facilmente degradados antes de chegarem aos tecidos alvo -> pode-se usar partículas lipídicas com o RNA lá dentro
Qual é a origem do sistema CRISPR/Cas9?
É um sistema endógeno das bactérias para proteção contra vírus.
Quais os 2 componentes do sistema CRISPR/Cas9?
A enzima Cas9 e o guideRNA
Como funciona o sistema CRISR/Cas9 para edição de genes?
A enzima Cas9 associada ao guideRNA vai reconhecer a sequência no genoma complementar ao guideRNA e induzir um double strand break. A célula ao tentar reparar esta quebra pode recorrer ao nonhomologous end joining (NHEJ) que não é perfeito e por isso muitas vezes induz mutações, podendo resultar no knockdown do gene.
Qual a diferença entre nonhomologous end joining (NHEJ) e homology directed repair (HDR)?
NHEJ não usa um DNA template por isso está muito propício a induzir erros enquanto que HDR usa um DNA template fazendo com que a reparação seja perfeita.
O que é necessário ter em atenção na construção do guide RNA?
Tem que ter uma zona, tracrRNA que é um “sacffold” que é reconhecido pela Cas9 e um crRNA que é a zona do RNA que vai ser complementar ao nosso alvo. O alvo tem que também estar adjacente a uma PAM sequence que tem como sequência “NGG”.
De que formas pode ser usado o sistema CRISPR/Cas9?
-Indução de mutações de forma a produzir knock-outs
-Usando uma Cas9 sem domínio catalítico, esta vai se ligar ao DNA mas não o corta, funcionando como um inibidor da transcrição
-Associando moduladores epigenéticos ou moduladores da transcrição à Cas9, esta ao ligar-se ao DNA pode promover ou inibir a sua transcrição (estudar como modificações epiginéticas afetam a expressão genética)
-Cas9 associada a fluróforos pode marcar genes específicos
