qPCR Flashcards

Question 1

Q

Berätta om qPCR

Answer

A

PCR används vanligen i diagnostiken av infektionssjukdomar, cancer eller genetiska avvikelser.
Tekniken går ut på att amplifiera en specifik DNA sekvens, en målsekvens som sedan detekteras i realtid med fluorescerande prober exempel TaqMan (probebaserad metod) eller fluorescerande färg SYBR Green.
För att målsekvensen ska kunna amplifieras måste man veta hur början och slutet ser ut så att primers kan designas. Primers är oligonukleotider, 15-30 baser långa som är komplementära till 3’-ändarna på målsekvensen. Allt börjar med att DNA blandas med dNTPs, taq-polymeras, MgCl , PCR-buffert och primers och placeras 2 sedan i PCR maskinen.

qPCR sker sedan i fyra steg:

1. Denaturering: det dubbelsträngade DNA:t denatureras i 94-96 °C och vätebindningarna mellan kvävebaserna bryts.

2. Hybridisering: temperaturen sänks till 50-65°C och primrarna binder in till DNA-mallen.

3. Elongering: temperaturen höjs till 72 °C. Taq-polymeras binder in till primrarna och skapar nytt DNA. Den fria OH-gruppen på 3’ ändan gör så att polymeraset vet att det är där en ny nukleotid ska sättas till.

4. Repetition: proceduren börjar om igen.

TaqMan proben är märkt i sin 5’-ände med en fluorofor, så kallad reporter, och i sin 3’-ände märkt med en quencher.

Vid amplifiering av DNA:t binder proben till målssekvensen och under elongeringsfasen bryts proben ned och hydrolyseras av Taq-DNA-polymerasets 5’-exonukleas aktivitet och reportern och quencher skiljs åt.

Nu absorberas inte längre energin från den exciterade repotern av quenchern utan mäts istället av detektorn i qPCR-instrumentet.

Resultatet läses av som ett Ct-värde. Ct är förkortningen för “cycle threshold”. Fluorescenssignalen som bildas är proportionell mot mängden amplifierat DNA i realtids-PCR-reaktionen vilket medför att man kan kvantifiera nukleinsyrainnehållet i sitt ursprungsprov. Efter avslutad amplifiering i realtids-PCR-instrumentet med SYBR Green utförs en smältpunktsanalys.

Question 2

Q

Berätta om SYBR Green och smältpunktsanalys

Answer

A

SYBR green är ett fluorescerande färgämne som kan binda dubbelsträngat DNA.

Bindningen är ospecifik eftersom molekylen kan binda till vilket dubbelsträngat DNA som helst, därför kommer fluorescens att produceras av olika amplifieringsprodukter som exempelvis primerdimers (PD). Detta nödvändiggör en smältpunktsanalys vilket är en post-amplifikation analys av PCR-produkten, analysen kan skilja mellan DNAt och eventuella amplifieringsprodukter.

Analysen utförs genom en gradvis temperaturökning där fluorescensen mäts kontinuerligt, smältpunkten är då proportionell mot den temperatur där hälften av DNA-strängarna separerats och därmed hälften av SYBR green molekylerna lossnat från DNAt. Smälttemperaturen för DNA är mycket specifik och beror främst på basparsammansättningen men även längden på sekvensen

Smältpunktsanalys används tillsammans med SYBR green real-tids PCR, men smältpunktsanalys används också ofta vid användning av hybridiseringsprober.

Resultatet från en smältpunktsanalys kan redovisas i en s.k smältkurva. Kurvan visar förändringen av fluorescens som observeras när dsDNA med inkorporerade färgmolekyler åtskiljs, eller smälter till ssDNA vid temperaturökning. Till exempel då dsDNA binder SYBR green molekyler och hettas upp kan den plötsliga minskningen av fluorescens detekteras när smältpunkten nås. Detta är alltså på grund av upplösningen av DNA-strängarna och färg som sedan avges.

Question 3

Q

Förklara resultatet

Answer

A

*Y-axel -** fluorescensstyrka
*X-axel -** cykler

Threshold - man sätter en gräns för vilken mängd som överstiger “skräp”/bakgrund.

Ct - threshold cycle. Vid den här cykeln överstiger fluorsescenssignalen threshold.

Ju mer material som finns från början, desto tidigare (tidig cykel, lågt Ct-värde) överstiger provet threshold.

Ex grön kurva har mer ursprungligt material än röd kurva.

OBS! Dubbelprover måste köras för tillförlitligt resultat. Det kan finnas andra anledningar (störningar) som gör att den gröna dyker upp tidigare än den röda.

Question 4

Q

Beskriv relativ kvantifiering

Answer

A

Vi gör en relativ kvantifiering, som kan göras med hjälp av en referensgen (gener som vanligtvis uttrycks på en jämn nivå) och denna ekvationen. Man kan även göra en absolut kvantifiering vilket ger det exakta antalet DNA-molekyler - detta kräver en standardkurva. (Vi går inte in på exakt hur den här ekvationen fungerar, eftersom ingen har förklarat det, men Lisa skulle ju skicka ut något. Huvudsaken är att man använder sig av en gen som normalt uttrycks på en konstant nivå för att se om den gen man undersöker uttrycks mer eller mindre i förhållande till referensgenen.)

Question 5

Q

Berätta om qRT-PCR

Vad står de för?
Kan man använda RNA direkt?
När använder man de?
Berätta om de olika varianterna
Detektion med?
Svårigheter?

Answer

A

qRT-PCR står för quantitative Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction och används när man vill detektera, amplifiera och kvantifiera RNA genom qPCR.

PCR använder sig av Taq-polymeras som är ett DNA-polymeras och kan därför inte arbeta med RNA direkt. RNA måste omvandlas till komplementärt DNA (kallat cDNA) innan PCR-reaktionen kan starta. Detta görs mha enzymet reverst transkriptas (RT). Enzymet hittas ursprungligen hos vissa virus som har RNA som genetiskt material och kan skapa en komplementär DNA-sträng utifrån en RNA mall.

Men när vill man göra så här? När är det relevant att titta på RNA istället för DNA? RNA kan behöva detekteras exempelvis vid en misstänkt infektion med RNA-virus. Man kan också använda metoden när man vill undersöka hur mycket en specifik gen uttrycks, genom att kvantifiera mängden mRNA. Detta kan vara intressant vid exempelvis monitorering av cancerpatienter, då man kan se hur mycket en onkogen uttrycks och om uttrycket minskar genom behandling. Metoden används även för att undersöka genetiska sjukdomar. Metoden är mycket känslig och kräver inget stort provmaterial.

Det finns två olika varianter av qRT-PCR som i korthet går ut på att man antingen använder ett rör till hela processen eller delar upp reaktionerna i två rör.

I ett-stegs-metoden tillsätter man RT till mastermixen och provet direkt, allt i samma rör. Denna metod innebär mindre risk för kontaminering, eftersom man inte flyttar provet mellan rör och därmed hanterar det mindre. Den minimerade hanteringen av provet innebär också en mindre variation av resultat om man upprepar testet. Ett-steg är att föredra när man använder sig av SYBR Green, eftersom man enkelt kan slippa undan primer-dimers (oönskade produkter som annars kan amplifieras i stor mängd) genom att ändra smälttemperaturen.

I två-stegs-metoden använder man sig av två olika rör och delar upp reaktionerna. I det första röret har man mastermix, provmaterialet och RT - här omvandlas RNA till cDNA under en cykel. När detta har skett inaktiverar man RT genom en temperaturhöjning. Provmaterialet, som nu består av cDNA, förs sedan över till ett nytt rör som genomgår “vanlig” qPCR (det är alltså här man amplifierar och detekterar materialet). Denna metod innebär mer hantering av provet, vilket både medför en kontaminationsrisk och dessutom är mer arbetskrävande än ett-stegs-metoden. Fördelen med denna metod är att cDNA:t som bildats är mer stabilt än RNA och lättare kan sparas. Två-stegs-metoden rekommenderas om man ska utföra flera analyser på samma prov.

Detektion i realtid för båda varianterna av qRT-PCR sker på samma sätt som vid “vanlig” cPCR, alltså med exempelvis SYBR Green eller Taqman-prob.

Vissa svårigheter finns så klart med metoden. Till exempel kan, precis som vid “vanlig” qPCR, mycket små kontaminationer av DNA leda till ett helt missvisande resultat. Det centrala problemet är dock RNA:ts instabilitet. RNaser (enzymer) finns i princip överallt, vi har dem på huden och de bryter ner RNA. RNaser är dessutom värmestabila, så det hjälper inte att hetta upp provet för att bli av med dem. Det är viktigt att arbeta RNas-fritt om man ska göra qRT-PCR, så glöm inte handskarna!

Question 6

Q

För och nackdelar (jämförelse av Taqman-prober och SYBR Green)?

Answer

A

Vid jämförelse av Sybr Green och prober ses främst att prober är en betydligt dyrare metod - MEN de är mycket mer specifika.

Om man sedan innan vet sekvensen av det man vill amplifiera: kan prober användas, då man utformar prober som binder specifikt till sin målsekvens och därmed endast avger fluorescence när denna sekvens amplifieras av polymeras och proben klyvs. På detta sätt detekteras inte primer-dimers - till skillnad från när Sybr Green används, då Sybr Green binder till ALL dubbelsträngad DNA, dvs både det är den specifika målsekvensen, primer-dimers och andra ospecifika produkter.

Dock kan inte prober användas för att detektera: eventuella patogener med icke-sekvenserat genom eftersom den specifika målsekvensen inte är känd och en komplementär sekvens som proben utgörs av kan inte skapas.

Prober kan användas för att detektera: single nucleotide polymorphisms (SNP’s) och mutationer, till skillnad från Sybr Green.

När det gäller mätning av genuttryck: har prober högre nivå gällande kvantifiering och är därför att föredra framför Sybr Green som har lägre nivå. En stor fördel med användning av prober är dessutom att olika sekvenser i samma prov kan detekteras samtidigt och visualiseras med olika färger för att skilja dem åt, såkallat “multiplexing”, då olika prober med olika reporter-färger används. Man kan dessutom detektera mycket små mängder av önskad målsekvens och risken för kontamination är betydligt lägre jämfört med Sybr Green.

En nackdel med probe-användning är: det faktum att olika prober måste användas för olika sekvenser, till skillnad från vid användning av Sybr Green där all dsDNA detekteras. Detta är ingen nackdel om man bara har ett par specifika sekvenser man vill detektera, men om man vill detektera större delar av ett genom exempelvis blir det väldigt många prober som behöver användas.

Vid användning av prober finns dessutom färdiga kit att köpa: som riktar sig till specifika sekvenser medan vid användning av Sybr Green krävs en del optimering av användaren för att ge lika bra resultat. Primrar som är optimalt designade är alltid väsentligt för PCR, men extra viktigt när man använder sig av Sybr Green eftersom målsekvensen helt kan missas om primrarna inte binder in där man önskar.

Probernas fluorescence från den hydrolyserade reporten bör vara av god kvalitet för att överstiga “bakgrundsbrus” och om flera prober som emitterar olika färger används samtidigt måste “spectral overlap” undvikas för att få ett så bra resultat som möjligt. De färdiga kiten med prober är dock redan optimerade för att undvika detta. En annan stor fördel med prober är att fluorescerande signal endast ges vid hybridisering av proben på den specifika målsekvensen och risken för falsk fluorescerande signal är därmed mycket låg.

Den tydliga fördelen med Sybr Green i jämförelse med prober: är dess låga kostnad vilket kan vara en avgörande faktor för vissa projekt. Det är även en mycket god metod att använda om primrarna är optimalt designade och PCR-processen genomförs korrekt, och resultatet kan då bli nästan lika specifikt som vid användning av prober.

En annan aspekt av användningen av DNA-färger: såsom Sybr Green är det faktum att ju längre en amplifierad dsDNA produkt är, desto fler färgmolekyler binder in och ger fluorescens. Detta innebär att signalen blir svagare för en kortare dsDNA-sekvens och mycket starkare för en lång sekvens. Vid användning av prober däremot blir fluoroscerande signalen alltid densamma oavsett längden på DNA:t.

Brainscape's Knowledge GenomeTM

qPCR Flashcards

Brainscape's Knowledge Genome^TM