long range PCR

Question 1

• Varför vill man göra hot start?
• Hur gjorde man först? (historia)
• Moderna metoder?
  *

Answer 1

Varför vill man göra hot start?

minimera chanserna av felprimning och felaktig extension som kan uppstå på grund av ospecifik inbindning under upphettnings steget. Detta uppnås genom att polymeraset inte är aktiverat eller tillsatt innan amplifieringssteget ska startas.

Historia - hur gjorde man först?

Den första metoden som användes var att tillsätta DNA-polymeraset när denatureringstemperaturen var uppnådd. Denna metoden är inte den smidigaste eftersom man tar ut rören ur maskinen vilket leder till temporär nedkylning av provet samt öppnas proven vilket kan leda till “cross contamination”. Proven får på så vis inte samma behandling/historia vilket kan påverka resultatet (speciellt om man har flera rör som ska köras samtidigt). Det finns också andra småsaker som risken att bränna fingrarna på de varma proven. (Michael knows that feel).

moderna metoder:

Hot Wax

i denna metod separeras reaktanterna till pcr reaktionen fysiskt genom att man sätter en vaxbarriär mellan dem. Det görs genom att smälta en vaxkula som vid stelning bildar ett lager mellan reaktanterna. när mixen sedan når en högre temperatur smälter denna barriär och reaktanterna kan reagera med varandra.

Inhibering

• Deoxyribonukleotid trifosfat (dNTP) modifieringar: kemisk modifiering på dNTP gör att den bara binder till DNAt efter reaktionsmixen är uppvärmd.
• (dNTPs funktion i en PCR är att tillsätta nukleotider som sätts på kedjan som kopieras.)

Antikroppar osv

inhibering av Taq-polymeras med hjälp av antikroppar som har en inaktiverande effekt tills de denatureras vid högre temperaturer.

Amplitac (Gold)

Kemiskt modifierad Amplitaq polymeras som aktiveras under högre temperaturer.

Question 2

Beskriv Själva laborationsarbetet (templat DNA)

Answer 2

OBS: jag (Niki) har i skrivande stund inte fått in Tiffanys material så skriver mer generellt och väldigt kortfattat utifrån det jag vet och det jag vill minnas att vi diskuterat vid gruppmöten.

Själva laborationsarbetet:

• Se till att hantera dina DNA-prov varsamt. Håll dem på is och vortexa dem inte eller behandla dem på andra sätt inte våldsamt. Frys/tina ej flera gånger. Pipettera varligt. DNAt är känsligt.
• I long range PCR vill vi ha långa intakta DNA fragment utan nicks. (Nicks = ”gluggar”/hål i nukleotidsekvensen.
• Vi vill inte ha för mycket DNA (risk för ospecificitet i primerinbindningarna) men vi vill inte heller ha för lite (inte tillräckligt med templat för att kunna polymerisera och amplifiera vår valda sekvens). Mellan 50-300 ng är lagom.

Question 3

Berätta om primers

Answer 3

Primrar som används för long PCR brukar vara längre (mellan 30-40 bp) än de som används för standard PCR (18-22 bp). De längre primrarna tillåter för en högre annealingstemperatur samt att en kombinerad annealing/extensionssteg vid 68 grader celcius kan användas. Annealingstemperaturen påverkas även av primers sekvens, dvs GC innehållet. GC parning med tre vätebindningar är starkare än AT parning med två vätebindningar. Alltså ju fler G och C det finns i primerna desto starkare binder den till dess template. Den höga annealing temperatur leder till att bindningen mellan primers och målsekvensen blir stabil nog och mer specifik för att amplifiering kan ske. Om temperaturen är för låg, blir systemet tolerant för delvis mismatchade primer/template. Alltså det blir ospecifik inbindning vilket leder till oönskade slutprodukter. Tm värdet är temperaturen då våra primers smälter och då hälften av DNA-dubbelhelixen dissacosierar och blir enkelsträngat DNA. Värdet är en indikation på dubbelhelixens stabilitet. Värdet bör vara 5 grader över annealingenstemperaturen vilket ökar sannolikheten av primer inbindning.

Question 4

Berätta om enzymer

Answer 4

Den största skillnaden mella LX-PCR och konventionell PCR syftar på den långa sekvensen som skall amplifieras. Vid val av polymeras bör man fundera över:

Termostabilitet - Polymerasets stabilitet vid högre temperaturer under thermal cycling.

Termostabila polymeras tillåter bearbetning under (I) längre denaturerings perioder (II) denaturering under högre temperaturer (III) ökat antal termocycles (upp till 70). Alla polymeras har olika halveringstider och vissa är mer lämpade för högre temperaturer. För long PCR är mer termostabila polymeras att föredra pga de längre denaturerings perioderna och högre temperaturerna.

Fidelitet - Noggrannheten av DNA replikeringen

Polymeras med proofreading räknas till high-fidelity polymeras och producerar mindre fel inkorporerade baser. Denna faktor är högst beroende av längden hos det amplifierade materialet samt antal PCR cykler.

Processivity - Arbetstakten av polymeraset

Polymeras med hög processivitet arbetar snabbare och binder bättre till template strand under amplifiering, generellt sätt arbetar icke-proofreading polymeras snabbare än polymeras med proofreading.

Längre sekvenser ökar risken för fel inkorporering av nukleotider och för att bevara integriteten i DNA sekvensen samt för att upprätthålla effektiviteten används 2 polymeraser.

Två välkända polymeras är Taq polymeras och Pfu polymeras som kan köpas färdigblandade (Taq Plus™). Taq har ingen proofreading funktion och kan därför arbeta snabbare, alltså med en högre processivitet. Då Taq inte har någon proofreading är det nödvändigt att använda två polymeras. Ett predominant polymeras arbetar med att syntetisera sekvensen medans ett annat polymeras med 3´-5´ exonuclease activity(proofreading) korrigerar fel = hög fidelitet. Dessa två polymeras arbetar synergistiskt och komplementerar varandra hos fidelitet och processivitet. Användningen av två polymeras tillåter amplifieringen av längre fragment upp till 22kb(genomiskt DNA) med hög fidelitet, processivitet och högt utbyte. Andelen av enzym måste anpassas till PCR:en(med avseende på nukleotider, buffer, templat DNA), för mycket enzym kan resultera i ospecifik amplifiering vilket medför dålig specificitet.

(Slide: Kommersiella polymeras)

KOMMERSIELLA POLYMERAS

Flertalet kommersiella polymeras finns tillgängliga på marknaden med olika egenskaper. Ex. Vent har väldigt hög termostabilitet (~23h) i jämförelse med andra polymeras och har 3-5 proofreading. AmpliTaq är ett modifierat Taq enzym som kan användas till ”hot-start”.

Question 5

Berätta om

• Buffert
• depurinering
• enchanging agents

Answer 5

Buffert

Först och främst, vid val av buffert ska man välja den buffert som fungerar bäst med och kompletterar det enzym man valt i utformningen av sin long PCR. Fås ofta ihop med enzym man beställt från tillverkare. Generellt i PCR vill vi använda en buffer i pH intervallet 8-9.

En mycket viktig komponent i vår reaktionsmix i en PCR reaktion är magnesiumjoner som vi får från MgCl. Det är vanligt att dessa är inkluderade i bufferten, men för ökad specificitet och kontroll över enzymaktiviteten i experimentet kan vi använda en MgCl2-fri buffert och själva addera MgCl2 i en lämplig koncentration för det system vi utformar. Mg2+ joner fungerar som en cofaktor till polymerasernas, proteiners och nukleotiders aktivitet i en PCR. Magnesium bildar komplex med nukleotider i PCR och dessa komplex är de som fungerar som substrat för polymerasen i vår PCR. Dessa molekyler kelerar Mg2+ joner och därför är det viktigt att det finns tillräckligt mycket Mg2+ för att de ska ha något att jobba med. Med detta i åtanke blir det rätt så logiskt att förstå att de behövs högre MgCl2 koncentrationer i utformningen av en long range PCR än en standard PCR, vi har mer material att amplifiera vilket medför att vi bör använda högre koncentrationer dNTP i long range-körningar. Samtidigt vill vi inte ha för höga Mg2+ koncentrationer då det kommer göra att polymerasets -polymerisering över-katalyseras och det blir för reaktivt. Enzymet förlorar sin specificitet och vi får fler felaktigt placerade nukleotider. Dessutom gör för höga nivåer av magnesium att mismatchade protein blir mer stabila.

Generellt sett brukar en buffert med Tris-HCl (effective range 7.1 - 9.1) användas i PCR-körningar. Trisbufferten är nödvändig för att hålla vår reaction mix vid ett stabilt pH värde under körningens olika faser så att polymerisering och elongering utförs korrekt. Utöver Tris kan andra saltföreningar som t.ex. ammuniumsulfat ((NH4)2SO4) användas i bufferten för pH reglering. I princip alltid när man utför en PCR så erhåller man tillsammans med det enzym som används en komplementär buffertlösning som är optimerad för att använda med det enzym man valt för sin analys. Då dessa ofta kommer i höga koncentrationer och frysta är det viktigt att tina dem och noggrant blanda ut dem innan användning.

En alternativ kemikalie som kan användas för att konstruera buffert till long PCR är TAPS. TAPS har ett pKa värde på 8.44 vilket gör att den i buffert får ett effektivt intervall mellan pH 7.7 - 9.1. En anledning till varför man hellre skulle vilja välja en denna buffert är för att undvika låga pH-värden. Det är nämligen så att depurinering av DNA går fortare i låga pH-värden än i höga. pH-värde tillsamans med temperatur är två faktorer som påverkar depurinering av DNA. Genom att utforma en long range PCR körning i högre pH och i lägre temperaturer kan vi minimera depurineringsfrekvensen.

Även tricine och bicine är två möjliga buffertar vi kan använda i utformningen av vår PCR-körning. Dessa två bufferter har mer stabilt pKa-värde vid varierande temperaturer än vad TRIS har, vilket alltså gör deras pH reglering mer stabil under en PCR och leder till mindre flukturering av pH mellan de olika cyklernas steg. Tris-buffertars sjunker vid höga temperaturer Ett permanent pH gör det lättare att kontrollera PCRens resultat och minimera felkällor. (depurinering)

Ytterligare en sak som måste balanseras noggrant är balansen mellan koncentrationen av DNA polymeras och dNTPs. Om vi har för mycket enzym kan det resultera i att PCR produkten blir ospecifik. Om vi har för mycket fria nukleotider blir sannolikheten för missinkorporering av dessa i elongeringen större. Sen ska vi även tänka på att ha lika många av A, T, G och C så att det inte blir större sannolikhet att en viss nukleotid blir felaktigt inkorporerad pga att den finns i överflöd.

Depurinering

Depurinering är en form av DNA-skada som förekommer i spontana reaktioner som sker jämt och ständigt i kroppen och även i våra PCR-system. Vid depurinering försvinner purinbaser (Guanin eller adenin) från nukleotider. Detta gör att basparning på deras nukleotidposition inte kan ske och vi kan få punktmutationer som leder till frameshift-mutationer (deletion) när depurineringen inte åtgärdas eller att en felaktig substitution sker. Detta vill vi givetvis inte ha i long range PCR när målet är att amplifiera långa, intakta DNA fragment. Det är svårt att helt och hållet eliminera förekomsten av depuringeringar eftersom reaktionerna sker spontant, men det är känt att depurineringsreaktioner sker snabbare och mer frekvent i höga temperaturer och sura miljöer med lågt pH. Genom att på olika sätt påverka dessa två faktorer kan vi alltså göra insatser för att minimera depurinering i en long range PCR. … Vilket leder oss in på nästa ämne, enhancing agents.

Enhancing agents

Dessa är ämnen som används som tillsatser i PCR hjälper till att öka reaktionens utbyte och reaktionens specificitet på olika sätt.

DMSO - Dimetylsulfoxid (vanligt)

Vanlig tillsats i PCR. Används med fördel vid amplifiering av långa fragment som är GC-rika, alltså svårare att denaturera och öppna upp för primerinbindning. DMSO binder när det tillsätts till en master mix in till cytosin-baser i en GC-rik region och orsakar en konformationsändring. När cytosin genomgår sin konformationsändring görs nukleotiden mer värme-mottaglig, det krävs mindre energitillförsel att nu bryta dess basparbindning till det korresponderande guaninet. GC-rika regioner bildas ofta när det klyvits till enkelsträngar sekundärstrukturer i form av hairpins som är svåra att amplifiera korrekt i PCR. DMSO vid inbindning till cytosin förhindrar även att detta sker. Dessa effekter leder till att DMSO kan öka en PCRs specificitet och dess Tm så att inte lika hög denatureringstemperatur behövs. När vi sänker Tm sänker vi kravet på att nå höga temperaturer och vi kan få en mindre depurinerad PCR produkt.

Det har även setts att DMSO kan ändra DNA-topologi genom aktivering av typ I topoisomeraser. Men vi vill samtidigt inte ha för mycket DMSO då det likt för höga Mg2+ nivåer kan leda till att polymerasers aktivitet stimuleras och att de för enkelt kan koppla på nya nukleotider på sekvensen och vi får då felmatchade baspar. Det kan alltså tyvärr inducera mutagenes. (process som leder till mutationer i DNA) Så ej lämpligt om målet är att sekvensera.

För att optimera nivån av DMSO i en long range PCR på GC-rikt material krävs det många testkörningar med olika DMSO koncentrationer för att man ska kunna jämföra resultat och bestämma den koncentration som ses fungera bäst. Dessutom ev ändra annealing temperaturer osv

Betainer (vanligt)

Betainer är neutrala kemiska föreningar som har en positivt laddad katjonisk funktionell grupp och en negativt laddad funktionell grupp som t.ex. karboxylat som ej ligger intill varandra. De kan alltså vara en speciell form zwitterjoner. Det har setts att tillsatsen av betain till PCR körningar kan öka reaktionens specificitet genom att det minskar bildandet av sekundärstrukturer hos DNA dubbelsträngar med GC-rika regioner. Detta leder till att amplifiering av dessa strukturer går lättare och effektiviseras.

Andra enhancers som bara nämns:

Formamid

Polyethylene glycol (PEG 6000)

Sulfoner (tydligen bättre än de vanliga enl. en rapport)

Sulfoner är molekyler som är lika sulfoxider, men sulfoner har två st dubbelbundna syre till sin centrala svavelatom… Vid framställning av sulfoner från thioetrar (sulfider) är sulfoxider intermediärer i den reaktionen… Har setts vara mer effektiv än sulfoxider av ett forskarteam 2001, troligtvis på grund av att sulfoner har en extra syreatom och att de således ska kunna binda hårdare till grooves i DNA med vätebindningar då denna atom blir ett extra potentiellt inbindningsställe, särskilt i GC-rika regioner där det finns mycket väte-donatorer och vätebindnings-potential. Man tror också att i jämförelse med dimethylsulfoxid (DMSO) så gör DMSOs utstickande metylgrupper att den får svårare att få plats i grooves och binda in jämfört med sulfolan. (en av de sulfoner som granskades) Sulfolan hade ett smalare effektive range också, men det beror troligtvis på att den lättare får plats i grooves och lägre koncentration av vår additive krävs för att DNA-grooven ska bli mättad.

Take home message för depurinering: Det är long PCRs största fiende. Vi vill utsätta det DNA vi jobbar med för så låga temperaturer som möjligt under så kort tid som möjligt för att undvika depurinering i största möjliga mån.

Question 6

berätta om temperaturer, längd på cykler att tänka på med thermocyclern

Answer 6

Vid long PCR används ofta ett tvåstegs protokoll. För första steget är starttemperaturen 94 grader och höjs sedan till 98 grader. Detta varar då 10-15 cykler (5-10 sekunder) för att undvika till exempel depurinering, och gör att DNA-mallen denatureras, genom att till exempel bryta vätebindningarna. Annealing temperature, vilket är den temperatur som behövs för att primrarna ska para ihop sig med deras komplementära del på mallen, brukar vara mellan 68-74 grader och varar 20 sekunder. Den måste relateras till primrarna smältpunkt och måste därför bestämmas utefter den. På vanlig PCR brukar denna temperatur vara mellan 48-72 grader, oftast brukar den vara lägre än för LX-PCR. Parallellt med detta sker elongeringssteget och då förlänger polymeraset primrarna för att börja forma DNA-strängen. Elongeringssteget brukar vara ganska länge, 1-2 minuter/kb vilket ger cirka 20-40 minuter totalt då det är 20 kb och dess temperatur beror på enzymet.. Sedan börjar andra steget ifall PCRen är uppdelad i två steg, vilket börjar med denaturering vid 98 grader i cirka 20 sekunder, sedan kommer annealing-steget igen vid 68-74 grader i 20 sekunder i 16 cykler samtidigt som elongeringssteget. Sedan sker de sista cyklerna också på denna temperatur för att göra klart DNA-strängen och ta bort allt replikations-material. När allt är klart sätts PCR-maskinen till 4-10 grader för att behålla produkternas skick.

Tänk på: använd tunnväggade PCR-rör och inget annat! Använd också små volymer, mindre än 50 μl eftersom det är snabba temperaturförändringar och det möjliggör för mer effektiv energiöverföring mellan maskin och prov än tjocka rör.

Question 7

• Berätta om vektorer¨*
• Lämpliga typer, berätta om dem

Answer 7

VEKTORER

Finns två lämpliga typer av vektorer att använda vid Long PCR:

• λ Bakteriofager
• Cosmider

λBakteriofager:

Vektorer baserade på λ Bakteriofager som används primärt för att klona fram längre fragment utav DNA från 5 kilobaspar till 25 i E.coli, där de flesta är för stora att hanteras utav plasmid vektorer. λ bakteriofagen kan inte bära mer än 52kb i sin huvudstruktur innan den blir ineffektiv. Man kan ta bort ett stort segment i den centrala regionen av λ DNA:t utan att påverka fagens förmåga att infektera och producera nya fagpartiklar det vill säga des lytiska cykel. Detta segment kallas för den ”icke essentiella” regionen och innehåller gener involverade i integrering och bortskärning av λ lambda profagen från E.coli kromosomen. Borttagning utav detta segment förstör fagens förmåga att följa sin lysogena infektions cykel.

Finns 2 klasser utav λ bakteriofag baserade klonings vektorer:

• Insättningsvektorer
• Utbytesvektorer

Insättnings vektorer:

Med en insättningsvektor har ett stort segment utav den icke essentiella regionen blivit borttagen. En insättningsvektor har som minst ett unikt restriktions säte som nytt DNA kan sättas in i. Storleken på DNA fragmentet som en individuell vektor kan bära beror på hur mycket utav den icke essentiella regionen som har tagits bort. Endast 5-11kb kan sättas in vilket innebär att vi inte kan använda den.

Utbytes vektorer:

En utbytes vektor har två rekognition sites för restriktions endonukleas som används för kloning. Dessa siter flankerar ett segment av DNA, kallat stuffer fragment, som byts ut av DNA:t som ska bli klonat. Oftast bär det utbytbara fragmentet på ytterligare restriktions säten som kan brytas upp i mindre bitar vilket gör att återinförandet utav dessa under kloningen blir väldigt osannolik. Utbytes vektorer är generellt designade att bära större DNA fragment än insättnings vektorer kan hantera. Beroende på vektor samt hur mycket λ DNA som tagits bort kan den bära mellan 7–24 kb.

Lämpliga utbytesvektorer:

• λDASHII: 9–23 kb
• Charon 33: 9–20 kb Charon 34 och 35: 10–21 kb
• Charon 40: 9,2–24,2 kb
• EMBL3, EMBL4 och EMBL3A: 7–20 kb
• λ2001, λDASH, λFIX :10–22 kb

Cosmid:

En annan vektor som kan användas för långa DNA fragment är cosmider som är en λ-baserad typ av vektor. Cosmider är hybrider mellan en fag DNA molekyl och en bakteriell plasmid. Designen utgår från det faktum att enzymerna som packar λ DNA molekylen in i fagens proteinhölje endast behöver cos sites för att funka. Cosmiden är helt enkelt en plasmid som bär på ett cos säte. Den behöver också en markör (ex. ampicillin resistens gen) och en plasmid origin för replikation då cosmider saknar alla λ gener. Funkar inte endast för λ genom utan även med andra DNA molekyler som bär på cos säten. λ Bakteriefagen kan, som tidigare nämnt, bära upp till 52 kb långt DNA men som minst 38,5 kb. Cosmider är vanligtvis kring 5 kb i storlek och kan användas för att klona fragment mellan 33,5–47 kb. Detta är för stort för vårt syfte.

Charomid:

Charmoid är en modifierad cosmid som bär på utfyllnads sekvenser bestående av huvud-till-svans upprepningar av 2 kb fragment som kan upprepas 1-23 gånger. Detta möjliggör för charomid vektorer att bära sekvenser mellan 2–45 kb. För att få in vårt 20 kb DNA behövs minst 18,5 kb linker DNA. Används på samma sätt som en vanlig cosmid.

Kloning med Cosmid

Cosmiden öppnas upp vid sitt unika restriktions site och nytt DNA sätts in. Dessa fragment är vanligtvis producerade av ofullständig spjälkning av restriktions endonukleaset då fullständig spjälkning nästan alltid resulterar i fragment som är för små för att klonas med en cosmid. Förutsatt att det insatta DNA:t är av rätt storlek kommer in vitro förpackningar att klyva cos siterna och placera den rekombinerade cosmiden in i en mogen fag partikel. Dessa λ fag partiklar används till att infektera E.coli.

Question 8

Användningsområden för Long Range PCR?

Answer 8

Kan man kanske utredda vissa sjukdomar?

Mitokondriella sjukdomar:

• Mitokondrien har sin egen arvsmassa. Den är cirkulär och dubbelsträngad DNA. När det sker skador mtDNA tex när det kopieras den kan man få olika sjukdomar. Det kan vara att det skett en mutation i proteinerna som kopierar mtDNA eller de proteiner som transkriberar mtDNA som leder till att den färdiga kopian blir skadat.
• Symptom som visar att man har mitokondriell sjukdom är tex:
• Diabetes, Muskelsvaghet, Hörselnedsättning , problem med balans och koordination (ataxi), inlärningssvårigheter, kramper → detta på grund av lägre ATP produktion.

Andra sjukdomar:

Pearson’s syndrom

• Dör oftast under de första 1-2 åren
• Symptom: växer dåligt, Anemi, Progressiv sjukdom, Diabetes, Leversvikt (dödsorsaken)
• Behandling saknas.
• En del av genomet har förlorats → deletion
• Förlorat gener som kodar för komponenter i andningskedjan→ andningskedjan fungerar inte som den skall och ATP produceras inte i tillräcklig utsträckning.
• Vid diagnos kollar man på heteroplasmi → Kollar proportionen mellan normalt och muterad mtDNA, finns oftast en blandning och mängden skadad mtDNA avgör om man blir sjuk.

Leber’s hereditary optic neuropathy ( LHON)

Plötslig blindhet, näthinnans celler slutar fungera

Progressive external ophthalmoplegia (PEO)

Svaghet i de yttre ögonmusklerna, ytterligare symptom är att man tappar hörsel , svårigheter med att svälja och ataxi.

Olika sjukdomar som orsakas av kromosomrubbningar:

Retts syndrom

störningar i hjärnan som utvecklar psykisk utvecklingsstörning, svårighet i samspelet med andra människor och problem med målmedvetna rörelser.

Downs syndrom

Personen har en extra kromosom 21 har då 3 uppsättningar av kromosom 21. Vanliga formen av intellektuell funktionsnedsättning.

Turners syndrom

• En del av arvsmassan saknas på könskromosomen → barnet växer långsammare, äggstockar fungerar inte som de ska, hjärtproblem, svårt att använda sinnena, lättare att få olika typer av infektioner etc (symptomen varierar till person)
• Drabbas bara tjejer
• Hormoner behandlar patienten

Forskning? Gen-bibliotek? Kromosomanalyser?

Inom forskning brukar man forska inom (CNV) copy number variation: är ett fenomen där delar av genomet upprepas och antalet upprepningar i genomet varierar mellan individer. Ofta kan man tro att gener finns i två exemplar i ett genom men det kan variera i kopiaantal. (Kan ha betydelse inom cancer, då att genkopieringsnumret kan förhöjas i cancerceller och medicinsk forkning= kartlägga gener som orsakar vanliga sjukdomar)

Gen-bibliotek används för att identifiera och isolera gener från en organism. Det är en omfattande samling av DNA-fragment som klonats från en viss organism/ vävnad/ organ eller viss celltyp. Biblioteket kan innehålla fullständiga genomsekvenser eller sekvenser av komplementärt DNA.

Question 9

När använder man long range PCR?

Answer 9

När du har en frågeställning där du har långa gener ex. (När man vill kolla klona en hel gen t.ex.)