FISH Flashcards

Question 1

Q

Beskriv kromsomuppbyggnaden

Answer

A

Kroppen innehåller ett stort antal celler och inuti varje cell finns en cellkärna. Varje cellkärna innehåller kromosomer som är bärare av våra gener. Kromosomerna består, i sin tur, av deoxyribonukleinsyra (DNA) som är vår arvsmassa. Kromosomen består av två DNA strängar som tillsammans bildar en dubbelhelix (spiral). DNA-strängarna som finns i kromosomen är lindade runt histoner och packade på olika sätt, utifrån cellens olika faser. “Packaging proteins”, tillsammans med chaperon-proteiner, binder till och kondenserar DNA-molekylen, så att den packas och formas rätt.

DNA-strängarna är uppbyggda av nukleotider som binder ihop de två DNA strängarna som en repstege. Nukleotiderna består utav sockermolekyl, fosfatgrupp och kvävebas. Det är kvävebaserna i nukleotiden som binder samman DNA strängarna. Kvävebaserna som förekommer i DNA är guanin (G), cytosin (C), adenin (A) och tymin (T). G paras till C via tre vätebindningar, och A och T binder till varandra med två vätebindningar.

Generna som kromosomerna innehåller utgör en mall för proteiner. Utifrån hur kvävebaserna sitter ihop, och i vilken ordning, kodar de för olika proteiner som behövs för cellens korrekta funktion.

I metafas består kromosomen av två kromatider, alltså de två identiska delarna av en kromosom. Kromatiderna sitter ihop i en punkt kallad centomer. Den korta armen på en kromsom kallas för p-arm och den långa för q-arm. Varje ände av en kromosom avslutas med en telomer. Utifrån centromerens läge delar man in kromosomen i metacentriska, submetacentriska och acrocentriska kromosomer.

Kromosomer kan avvika i dessa former, vilket kallas för strukturell avvikelse. Dessa kromosomer avviker främst i struktur och utseende. Detta kan bero på att delar av kromosomen saknas eller extra delar tillkommit. Dessa fel uppkommer när kromosomen ska kopieras och sammansmältas med övriga kromosomer.

Vid fall där antalet kromosomer varierar, kallas för numerisk avvikelse. Kromosomerna kan antigen vara fler eller färre än normalt. Detta orsakas genom felaktig fördelning av kromosomerna till könscellerna, vilket sker som oftast av en slump. Exempel på detta är down syndrom, som har en kromosom extra.

Question 2

Q

Berätta om kromosom avvikelser

Hur vanligt är de?

Vad innebär de?

Vad är en numerisk avvikelse?

Vad menas med konstitutionella avvikelser och förvärvade?

Vad omfattas?

Kännetecken?

Answer

A

I Sverige föds det mellan 600-900 barn om året med någon form av kromosomavvikelse. Fler än 60% tidiga missfall beror på allvarliga kromosomfel.

Kromosomavvikelser innebär att kromosomuppsättningen hos en individ avviker från det normala antalet kromosomer och/eller att en eller flera kromosomer har en förändrad struktur.

Numeriska avvikelser uppstår vanligen genom slumpmässig felaktig fördelning av kromosomer till könscellerna, men kan också uppstå vid den första celldelningen efter befruktningen.Att det rör sig om hela kromosomer gör att ett mycket stort antal gener omfattas och konsekvenserna blir därför stora.

Kromosomavvikelser kan delas upp i konstitutionella, som finns i samtliga somatiska celler, och i förvärvade, som uppstår senare i livet. Medfödda kromosomavvikelser är vanligast och har oftast en början i det befruktade äggen. Ibland kan avvikelsen uppstå först efter att ägget har delat sig ett antal gånger, vilket då resulterar i att förändringen endast kommer att finnas i en del av kroppens celler. Detta kallas för kromosomal mosaicism.

Kromosomavvikelser som omfattar kromosom 1-22 ger i allmänhet fler och betydligt allvarligare symtom, jämfört med avvikelserna i könskromosomerna X eller Y. Om två individer har samma kromosomavvikelse, kommer båda ha liknande symtom, även om det kan skilja sig åt väldigt mycket mellan dessa.

Typiska kännetecken för kromosomavvikelser är utvecklingsstörning och/eller autism, missbildningar, ett specifikt utseende och tillväxthämning. Epilepsi förekommer också.
Missbildningar kan vara avvikelser i hjärta, njurar, hjärnan, öron, urinvägar och genitalier.

Vanligast bland hjärtmissbildningarna är en öppning i skiljeväggen mellan hjärtats kamrar (ventrikelseptumdefekt) eller en öppen förbindelse mellan vänstra lungartären och stora kroppspulsådern (ductus arteriosus persistens). Skelettavvikelser kan också förekomma, till exempel sned rygg (skolios) och bröstkorgsavvikelser. Missbildning av fingrar och tår förekommer. Det kan finnas extra fingrar och tår. Fingrar och tår kan även vara sammanväxta eller onormalt böjda åt sidan. I handen kan det finnas en fyrfingerfåra, en sammansmältning av handflatans övre tvärfåror.

Question 3

Q

Berätta om typer av kromosomavvikelser

Answer

A

Strukturella:

● Robertsonsk translokation – innebär att de två långa armarna på två icke-homologa akrocentriska kromosomer fusionerar vid centromeren. De två korta armarna förloras.

● Reciprok translokation – när två icke-homologa kromosomer utbyter genetiskt material.

● Duplikationer – en del av kromosomen duplikeras, vilket resulterar i extra genetiskt material. Charcot-Marie-Tooth disease type 1A.

● Deletioner – en bit av en kromosom förloras, kan antingen vara en terminal del eller ett mittensegment. Wolf-Hirschhorn syndrome och Jacobsen syndrome. deletioner kan vara stora och omfatta en hel kromosomarm, men är iböland så små att de inte kan uppfattas i mikroskop - och kallas då för mikrodeletioner. Konsekvenserna av deletionen beror på vilka gener som ingår i den kromosombit som fallit bort.

● Inversioner – ett kromosomalt segment bryts på två punkter, vrids 180 grader och slutligen återsluts vid de brytna ändarna. om kromosomavbrotten sker på olika kromosomarmar kommer kromosomernas centromerer att omfattas i inversionen och den kallas då pericentrisk. Om kromosomavbrotten sker i en kromosomarm kallas den paracentrisk

● Ringkromosomer – när ändarna av en kromosom fusioneras. Detta kan ske med och utan att genetiskt material förloras.

● Insertion – ett eller fler extra nukleotidpar hamnar i en DNA-sekvens.

Numeriska:

● Trisomi– när en person har tre exemplar istället för två av någon kromosom i sina celler. Den vanligaste trisomin är den för kromosom 21, även kallat Downs syndrom.

● monosomi- enstaka kromosomer saknas, exempelvis Turners syndrom där en x-kromosom saknas

Numeriska och strukturella:

● Isokromosomer-en isokromosom är en extra kromosom som avviker genom att ha identiska armar (två p-armar eller två q-armar). Detta uppstår om kromatiderna delar sig på fel sätt i centromeren, vilket ger upphov till två isokromosomer (en med två p-armar och en med två q-armar)

Question 4

Q

Genetiska sjukdomar som beror på kromosomavvikelser?

Answer

A

Genetiska sjukdomar som beror på duplikationer:

Charcot-Marie-Tooth disease type 1A(CMT1A) – ärftlig neurologisk störning som påverkar de perifera nerverna. Människor med denna sjukdom upplever svaghet och atrofi i benen, och kan senare även få svaghet i händerna och sensorisk förlust. Orsakas av en duplikation av PMP22-genen, och ärvs på ett autosomalt dominerande sätt.

Genetiska sjukdomar som beror på deletioner:

Wolf-Hirschhorn syndrom(Monosomi 4p-syndomet) – en medfödd kromosomavvikelse som medför utvecklingsstörning och olika typer av missbildningar. Innebär även ofta muskelsvaghet, missbildningar i ögonen, gomspalt, hjärtmissbildningar, hörselnedsättningar och svårigheter att räta ut fingrar. De flesta som föds med syndromet har även svår epilepsi. 1 barn på 50 000, och vanligare hos flickor än pojkar.

Jacobsen syndrom(11q-deletionssyndromet) – en medfödd kromosomavvikelse där många har medfödda hjärtfel, missbildningar i mag-tarmkanalen och i urinvägarna. Det är vanligt med både brist på trombocyter och att trombocyternas funktion är felaktig, vilket ökar risken för blödningar. Immunbrist förekommer hos de flesta, och uppvisar sig genom upprepande bakteriella infektioner. 1 på 100 000 födda barn, dubbelt så många flickor som pojkar med syndromet. Jacobsen syndrom orsakas av ett en del av den långa armen (q-armen) saknas på en av kromosomerna i kromosompar 11.

Genetiska sjukdomar som beror på trisomi:

Downs syndrom– en medfödd kromosomavvikelse som leder till utvecklingsstörningar. Personer med Downs syndrom har vanligtvis en kognitiv förmåga som är lägre än genomsnittet. Det finns även specifika utseendedrag som är vanliga för syndromet.

Incidensen är 1 per 800-1500.

Orsakas oftast (94%) av trisomi av kromosom nr 21 – trisomi-21, som uppstår vid bildningen av könsceller. Finns även translokationstrisomi 21(4%) där en extra kromosom nr 21 sitter fast med en annan kromosom, eller trisomi 21 mosaik(2%) där det förekommer en blandning av vanliga celler och celler med kromosomavvikelsen trisomi21.Denmestsällanförekommandevariantenärpartielltrisomi21(0,1%),där en bit av kromosom 21 finns i tre uppsättningar i cellerna. Ett extra segment av kromsom 21 sitter på en annan kromsom.

Genetiska sjukdomar som beror på könskromosomavvikelser:

Turners syndrom: (monosomi X). Flickor med avsaknad av en X-kromosom har bara 45 kromosomer. Syndromet kan även orsakas av att den ena X-kromosomen är strukturellt förändrad, till exempel en isokromosom eller en ringkromosom. Turners syndrom medför bland annat kortvuxenhet och infertilitet. En del av problemen vid Turners syndrom kan idag avhjälpas med medicinsk behandling.

Pojkar och flickor med en extra X eller Y-kromosom, XXX, XXY eller XYY, har en ökad benägenhet att få vissa psykosociala problem. De blir ofta längre än genomsnittet och pojkar med XXY är infertila.

Question 5

Q

Om det finns misstanke om avvikelser – vad gör man?

Answer

A

Klassisk kromosomanalys utförs om det finns en misstanke om de vanligaste triosomierna och könskromosomavvikelserna. Detta utförs även vid upprepade missfall, för att hitta möjlig orsak.

Vid misstanke om andra avvikelser, till exempel nyfödda barn med missbildningar och speciellt utseende, görs en arraybaserad gendosanalyssom möjliggör noggrann bestämning av avvikelsen. Det finns också olika metoder som kan användas under graviditeten för att utvärdera sannolikheten för kromosomavvikelser hos fostret. De vanligaste är KUB-test (kombinerat ultraljud och blodprov) och NIPT (non invasive prenatal testing). snabbmetoder som interfas-FISH används för att upptäcka de vanligaste kromosomavvikelserna (trisomi 13 och könskromosomavvikelser)

Question 6

Q

Karyotypning / studier av kromosomavvikelser, berätta om detta

Answer

A

En karyotyp är en bild och representation av kromosomerna i en cell. För att få bilden isoleras, färgas och undersöks kromosomerna under mikroskop. Oftast görs detta med hjälp av kromosomerna i de vita blodkropparna. En bild av kromosomerna tas genom mikroskopet.

Karyotypning är ett test för att identifiera och utvärdera storleken, formen och antalet kromosomer i ett prov av kroppsceller. Extra eller saknade kromosomer, eller onormala positioner av kromosomers delar, kan orsaka problem i en persons tillväxt, utveckling och kroppsfunktioner.

Vad vill vi ta reda på?

Ta reda på om kromosomerna hos en vuxen har en förändring som kan överföras till ett barn.
Ta reda på om en extra eller saknad kromosom förhindrar en kvinna från att bli gravid eller orsakar missfall.
Ta reda på om en extra eller saknad kromosom finns i ett foster.
Ta reda på orsaken till ett barns fosterskador eller funktionsnedsättning.
Hjälp med att bestämma lämplig behandling för vissa typer av cancer.
Identifiera en persons kön genom att kontrollera om Y-kromosomen finns.Detta kan göras när en nyfött kön inte är tydligt

Den klassiska metoden för karyotypning är så kallad kromosombandning.

Metoden går ut på att kromosomerna färgas in så att mörka och ljusa band att framträder, beroende på hur starkt de olika delarna eller banden färgats in. Olika färgningsmetoder får olika band att framträda. Kromosombandning är en bra metod vid screening, då man undersöker alla kromosomer samtidigt.

Den vanligaste typen av kromosombandning kallas G-bandning och använder Giemsafärgning, som innehåller metylenblått och azur B. Innan färgningen tillsätts trypsin. Giemsafärgning binder starkare till AT-baspar, vilket får AT-rika regioner att framträda som mörka band.

Det finns även Q-bandning som använder fluorescent färg, till exempel mepakrin, som är så kallade interkalatorer, vilket innebär att de passar in sig i mellanrummet mellan DNA-baserna. Q-bandning ger samma mönster som G-bandning vid 60 grader celsius. Vid så kallad C-bandning utsätter man kromosomerna för först en sur och sedan alkalisk miljö innan man färgar dem med Giemsa. Den här behandlingen får kromosomernas heterokromatindelar att framträda: främst centromererna men ibland också telomererna.

G-bandning används vid misstanke om kromosomavvikelse, som vid utvecklingsförsening, infertilitetsundersökningar och vid könskromosomavvikelser som vid Turners syndrom och Klinefelters syndrom.

Question 7

Q

Berätta om generellt om FISH, Fluorescent in situ Hybridisering

Answer

A

Fluorescent in situ Hybridisering är en metod som används för att detektera och lokalisera specifika DNA sekvenser på kromosomer. Metoden bildar sig på användning av fluorokromer för att detektera sekvenserna. Analysprincipen går ut på att en probe som matchar den eftersökta DNA sekvensen bildas. Till proben är fluorokromer bundna. DNA sekvensen och proben denatureras så att dubbelsträngen bryts. Nu kan proben med fluorokromerna binda in till den eftersökta enkelsträngade DNA sekvensen. Därom en bindning har skett vil fluorokromerna fluorescera och kan sedan detekteras i ett fluorescensmikroskop.

Man kan även göra en indirekt FISH. Då fäster man inte flurokromerna direkt till proben utan man fäster nukleotider med till exempel biotin. Därefter tillsätter man till exempel avidin som binder till biotin. Avdidin är du bundet till fluorokromer. Därom proben har fästat till den eftersökta sekvensen vill avidin/fluorokrom-komplexet fästa till biotin och fluorkoromerna kan undersökas i mikroskopet.

Vid FISH analyserar man vanligast vävnadsprover.

Question 8

Q

Vad finns de för olika typer av FISH?

Answer

A

Multicolor FISH:

Vid multicolor FISH (MFISH) så används olika fluorokromer som man kombinerar på olika sätt för att färga in varje kromosompar i olika färger. Färgskillnaderna är inte alltid synliga med blotta ögat men genom digital processering (datorprogram) kan man skilja de olika färgerna åt.

Multicolor FISH är användbart framförallt när man vill upptäcka translokationer i kromosomer. Vid multicolor FISH är det optimala att varje kromosompar har en specifik färg. Har man istället flerfärgade kromosomer är det något som inte stämmer, det kan finnas en translokation.

Genom att sen matcha färg med övriga kromosomer kan man se kromosomavvikelsens ursprung.

SKY:

SKY(spectral karyotyping) är en form av multicolor FISH och används också för att kartlägga translokationer. SKY och multicolor kan användas när det varit svårt att specificera translokationer vid vanlig karyotypering eller när man vill se markör kromosomer så som en extra kromosom med material från en annan kromosom.

I analysmetoden SKY kan 5 olika prober användas. Vardera prob har en fluorescens inmärkning med olika färger. När provet är inmärkt mäts de olika färgerna på olika våglängder med en kamera som tar bilder, dessa bilder sätts sedan ihop till en helhetsbild. Kromosomerna får en specifik färg beroendes på vilken typ av kromosom det är och kan därefter karyotyperas.

Multicolor och SKY är relativt lika varandra i metod, skillnaden ligger i avbildningen: SKY identifierar differentieringen av kromosomerna baserat på deras spektrala egenskaper, medan M-FISH identifierar differentieringen av kromosomerna baserat på en fluorokroms närvaro eller frånvaro när de visualiseras med specifika filter.

Microfluidic:

Metoden går ut på att hela FISH utförs i ett mikrosystem, vilket effektiviserar metoden.
Man använder sig av ett mikrochip där hela FISH-proceduren utförs.
Vid microfluidic används avsevärt mindre volymer och metoden är till stor del automatiserad.

Några av fördelarna med metoden är att kostnadesn är lägre än vid den vanlig metoden, detta pga att mindre volymer används samt att det kräver mindre personal. Metoden innebär också mindre slöseri med reagens. En annan fördel är också att det är mycket tidseffektivare,

Vanlig FISH kan ta dagar att utföra medan microfluidic tar timmar.

Question 9

Q

Sjukdomar som kan diagnostiseras med FISH

Answer

A

Många medfödda sjukdomar som är på grund av kromosomavvikelser kan diagnostiseras med FISH. En möjlig anledning till att detta undersöks kan vara att föräldrar som har barn med något utvecklingshinder vill se om avvikelsen är genetisk innan de skaffar fler barn. Då testas både föräldrarnas och barnets DNA.

Angelmans syndrom är ett exempel. Sjukdomen beror på att något med kromosom 15 inte är som det ska. Det kan vara en genetisk eller slumpmässig skada och i 3-7% av fallen beror syndromet på att personen har fått båda kromosomerna 15 från pappan och ingen från mamman.

Prader-Willi syndrom är ett annat exempel vilket medför utvecklingsstörningar, omåttlig aptit, kortväxthet, låg produktion av könshormoner och muskelslapphet. Andra genetiska sjukdomar är 22q13 deletion syndrom, chronic myelogenous leukemi, acute lympoblastic leukemi, Cri-duchat, Velocardiofacial syndrom och Down syndrom.

FISH är också fördelaktigt för att undersöka spermaceller från män som har en onormal somatisk eller meiotisk karyotyp eller för de som har oligozoospermia. Män som har oligozoosperma har i 50% av fallen en ökad mängd spermaceller med

kromosomala avvikelser. Detta undersöks genom att analysera kromosomerna 21, X och Y.

Även sekundära sjukdomar kan diagnostiseras med FISH, speciellt olika cancertyper. För bröstcancer analyseras biopsier från bröstcancerpatienter för att undersöka om cellerna har extra kopior av HER2 genen och HER2-receptorer finns närvarande. Dessa receptorer stimulerar nämligen tillväxten av bröstcancer celler. FISH är en mer noggrann metod för denna analys och visar antingen om cancercellerna är HER2 negativa eller positiva, dock används ImmunoHistoChemistry (IHC) mer frekvent då den är mer lättillgänglig.

Vid lungcancer används FISH för att detektera inversioner eller translokationer i ALK-genen. ALK-genen är belägen på den korta armen av kromosom 2 (2p23) och kodar för transmembran-tyrosinkinasreceptorn. ALK ska inte uttryckas i den vuxna lungan. Under patologiska förhållanden bryter ALK-genen dock och smälter dess 3 ‘(som innehåller tyrosinkinasdomänen) med 5’ från andra gener. Denna händelse kan leda till okontrollerad aktivering av ALK nedströms signalvägar. Den vanligaste fusionen inträffar med EML4 på grund av en inversion på kromosom 2s korta arm.

Uppföljning av sjukdomar görs också då metoden är noggrann och känslig.

Question 10

Q

Jämförelse “FISH vs. kromosombandning”

Answer

A

De främsta nackdelarna med FISH är att det är mer tidskrävande och mer kostsamt än kromosombandning. Den främsta nackdelen med kromosombandning är att upplösningen är låg, det vill säga att man inte kan urskilja tillräckligt små segment av genomet. Kromosombandning används därför ofta vid screening. Översiktsbilden man fått av kromosombandningen kan sedan kompletteras med FISH när och om man har en mer specifik frågeställning.

Brainscape's Knowledge GenomeTM

FISH Flashcards

Brainscape's Knowledge Genome^TM