Purification de protéine

Question 1

Paramètres de purification

Answer 1

• Solubilité (précipitation au sulfate d’ammonium des prot totale)
• Charge (chromato échangeuse d’ions)
• Densité (centri sur gradient)
• Hydrophobicité (chromato phase inverse)
• Marqueur ajouté (chromato d’affinité)

Question 2

Dosage de protéine

Answer 2

UV ou Colorimétrie

Méthodes de Buiret, Lowry, Bradford et BCA

Bradford (=bleu de Coomassie et A_595nm)

Question 3

Détection des protéines d’intérêt

Answer 3

• Test d’Activité (en U/mL)
• Dosage P_tot (en mg/mL) = P.V
• Mesure V_{<strong>tot</strong>} (en mL)
• Activité totale : A_tot = A x V
• Activité spécifique : A_spé = A_tot/P_tot = A/P
• Rendement R = A_{tot fin}/A_{tot ini}
• Facteur de purif F = A_{spé fin}/A_{spé ini}

Question 4

Séparation des protéines par chromatogaphie

Answer 4

• Gel filtration (V_élué/V₀ = f (log PM) (Séphadex G-10)
• Chromato échangeuse d’ions
  
  • Anions : DEAE
  • Cations : Carboxyméthyl
• Chromato d’affinité (ex : prot A pour Ig ou Lectine pour sucre)
• IMAC Immoblized Metal Affinity Chromato
  avec His-Tag ou autre
• HPLC

Dialyse entre chaque chromato pour diminuer NaCl

Question 5

Etapes chromatographie

Answer 5

1. Couler la résine dans la colonne
2. Laver
3. Equilibrer avec tampon
4. Dépôt échantillon
5. Lavage
6. Elution

Question 6

Contrôle de la purification

Answer 6

Electrophorèse monodimensionnelle en fonction des PM

Electrophorèse bidimensionnelle en fct des pHi et PM

Question 7

SDS-PAGE ou Native-PAGE

Answer 7

Stacking gel : concentre

Running gel : sépare en fct des PM

SDS (-) se fixe sur prot pour les faire migrer vers (+) et est retenu dans gel de séparation par friction

log (masse molaire) = f (mobilité relative) par rapport au front de migration

Question 8

Révélation des protéines

Answer 8

Western Blot