Puce à protéine Flashcards
Différents types de puce
- Forward phase array
- Sandwich phase assay
- Reverse phase assay
Forward phase array
- Protéines spécifiques fixées sur la lame
- Incubation avec échantillon biologique complexe (contenant protéines cibles)
Sandwich phase assay
- Sondes de capture fixées sur lame (anticorps monoclonaux)
- Bloquage pour éviter fixation aspécifique
- Incubation échantillon biologique et capture de la protéine d’intérêt
- Lavage
- Ajout de sondes de détection (anticorps –> formation d’une structure en sandwich (3 couches)
Reverse phase assay
- Echantillon biologique (contenant protéine cible) fixé à la puce
- Bloquage pour éviter fixation aspécifique
- Incubation avec protéine spécifique qui se fixe sur une protéine d’intérêt de l’échantillon
Application : Tests cliniques –> profil d’expression afin de montrer présence de marqueurs d’une pathologie
Comment préparer protéines recombinantes ?
Expression protéine par transformation et purification.
Expression protéines in-situ
- PISA
- NAPPA
- DAPA
PISA
Principe ?
Avantages ?
Protein In Situ Array.
- Dans une nanogoutte déposée sur lame, on a toute la machinerie transcriptionnelle/traductionnelle
- Ajout d’un ADN
- Synthèse protéine
- Protéine exprimée avec étiquette pour fixation sur la puce avec agent de capture
Avantages :
- Evite purification et dépôt
- Immobilisation et purification en une seule étape
- Intérêt pour protéines difficiles à exprimer (membranaires)
NAPPA
Principe ?
Avantage ?
Inconvénient ?
Rendement capture ?
Nucleic ADN Programmable Protein Array.
- Dans une nanogoutte déposée sur lame, on a toute la machinerie transcriptionnelle/traductionnelle
- ADN biotinylée sous forme plasmidique s’accroche à la streptavidine fixée sur la lame
- Synthèse protéine
- Protéine exprimée avec étiquette pour fixation sur la puce avec agent de capture
Avantage : conservation puce ADN
Inconvénient : Interaction protéine / ADN
Rendement capture : 10 femtomole
DAPA
Principe ?
Avantage ?
DNA array to Protein Array.
- Sandwich avec puce à ADN et puce avec agents de capture
- Entre les deux : membrane avec machinerie transcriptionnelle/traductionnelle
Avantage :
- une puce à ADN pour faire 20 puces à protéines
- évite interaction protéine / ADN
Les différents supports ?
- Supports plans
- Supports non-plans
Supports plans : lames ? caractéristiques ?
- lame de silice
- lame de verre :
- activée
- recouverte de nitrocellulose
- recouverte d’hydrogel
Caractéristiques :
- surface doit être extrêmement lisse/plane
- densité uniforme des groupements chimiques
Méthodes d’immobilisation des protéines ?
- Absorption
- Immobilisation covalente
- Capture par affinité
- Diffusion
Absorption
Principe ?
Inconvénient ?
Interaction non covalente :
- surfaces hydrophobes (nitrocellulose et polystyrène)
- surface chargée positivement (poly-L-lysine et aminosilane)
Inconvénient : Fixation avec orientation aléatoire
Immobilisation covalente
Principe ?
Avantages ?
Utilisation des amines primaire des lysines.
Couplage avec l’amine :
- lame fonctionnaliser avec COOH
- EDC réagit avec COOH –> intermédiaire amine réactif instable
- ajout NHS –> stabilisation intermédiaire en donnant ester NHS amine-réactif
- fixation covalente de la protéine par amine de lysine
Réaction Diels-Alder :
- lame d’or où il y’a autoassemblage des monocouches d’alkanethiolate
- alkanethiolate liée à groupement oligo éthylène glycol –> empêche adsorption aspécifique
- groupement oligo éthylène glycol lié à benzoquinone
- benzoquinone qui réagit avec cyclopentadiène (fixée à la protéine) par réaction Diels-Alder
Avantages :
- plus efficace et reproductible
- Diels-Alder : éloigne protéine du support
Capture par affinité
Avantage ?
- Protéine d’intérêt en fusion avec étiquette (ou sans étiquette)
- Lame fixée avec protéine à forte affinité pour l’étiquette (ou affinité avec l’anticorps)
Avantage : orientation uniforme
Diffusion
Puce avec hydrogel : protéine diffuse dedans
Dépôt des protéines ?
Inconvénient ?
Par des robots :
- Mode contact
- Mode non contact
- A flow continu
Lithographie :
- DIP-PEN nanolithographie
- Nanolithographie électronique
Inconvénient : adsorption aspécifique –> utilisation de BSA ou lait écrémé pour la caséine
Mode contact
Principe ?
Volume ?
- aiguille avec canal à l’intérieur pour mettre échantillon
- l’aiguille a une tête plate qui permet formation couche mince d’échantillon à l’extrémité de la pointe
- application sur la lame : mécanisme de tampon ancreur / impression
Volume : 0,25 uL
Mode non contact
Principe ?
Volume ?
Avantage ?
Echantillon déposé sans contact sur la surface
- vaporisation de l’échantillon avec des micro-gouttelettes (par jet d’encre, pulsation piézoélectrique ou électrospray)
Volume : centaine de pL
Avantage :
- évite d’endommager optique de la puce : pratique pour SPR car réseau optique proche de la lame
A flow continue
Principe ?
Volume ?
Avantages ?
Technologie qui utilise va et vient pour faire circuler la solution de protéine sur une zone bien précise.
Volume : bine plus bas que contact et non contact
Avantages :
- possibilité d’utiliser des solutions plus diluées
- aucune contamination des spots à proximité
- peut faire modification chimique sur le spot car on peut faire circuler ce que l’on veut
Dip-pen nanolithographie
Principe ?
Avantage ?
- stylo avec une pointe d’un microscope à force atomique
- l’encre c’est la solution biologique que l’on veut déposer
- en déplaçant la pointe sur la lame, formation d’un ménisque d’eau et les molécules se déposent
- l’écriture est séquentielle (pixel par pixel)
Avantage :
- peut faire multiplexage (déposer plusieurs protéines sur même support)
- on peut travailler dans des conditions ambiantes
- diminution volume échantillon
Nanolithographie électronique
Principe ?
Avantage ?
Application d’impulsion de potentiel entre une pointe métallisée d’un AFM et la couche métallique (support)
Avantage :
- en une seule étape
Détection : différentes façon de faire marquage
- Marquage direct : toutes les protéines dans un échantillon sont marquées
- Marquage indirect : anticorps secondaire marqué
- Marquage Immunotest en sandwich avec deux anticorps : protéine intérêt fixé en sandwich puis ajout anticorps secondaire marqué
Différentes façon de détecter ?
- Fluorescence
- Radioactivité
- Résonance Plasmonique de Surface
- Microscopie à Force Atomique
- Spectrométrie de masse
Fluorescence
Principe ?
Modes d’analyse ?
Augmenter sensibilité ?
Utilisation marqueur fluorescent.
Deux mode d’analyse :
- capture d’un instantané avec caméra CCD (Charged Coupled Device)
- lecture de la puce point par point à l’aide d’un tube photomultiplicateur
On peut augmenter sensibilité de détection de 3 façon :
- Guide d’onde planaire
- Nanocristaux
- Amplification d’ADN circulaire
Guide d’onde planaire
Principe ?
Structure ?
Limite détection ?
Avantage ?
- support en verre ou plastique transparent
- on le recouvre d’une couche de guidage qui permet à l’onde d’être guidé
- la puce est sur la couche de guidage
- création d’un champ évanescent au-dessus de la couche de guidage
- la lumière se cantonne aux 100 premiers nanomètres à la surface de la puce
- excitation sélective des fluorophores situées dans les 100 nanomètres au-dessus de la puce
Structure : tantalum pentoxide (Ta2O5)
Limite détection : 0,8 zmol
Avantage :
- améliore le rapport signal/bruit
Nanocristaux
Principe ? Constitution ? Limite détection ? Avantages ? Applications ?
- cristaux semi conducteurs de dimension nanométrique
- présentent des propriétés de fluorescence que l’on peut moduler en contrôlant leur diamètre
Constitution :
- coeur en Sélénure de Cadmium
- coquille de Sulfure de Zinc
- revêtement de polymères hydrophiles
- on peut recouvrir l’extérieur avec composés biologiques
Limite détection : 0,4 fmol
Avantages :
- multiplexage
- plus brillant : meilleur rapport signal/bruit
- durée de vie fluorescence plus longue qu’organique
- résiste au photoblanchiement
- large déplacement de Stokes
Applications :
- quantification miARN
- tester des protéases : particules d’or fixée à protéine fixée à nanocristaux recouvert de streptavidine pour se fixer à la lame. Absence de fluorescence des nanocristaux par FRET avec Or. Si protéase coupe protéine, libération particule d’Or et libération de la lumière.
Amplification d’ADN circulaire
Principe ?
Inconvénients ?
- oligonucléotide pré-annelé avec séquence ADN circulaire modèle
- fixation d’un oligonucléotide à un anticorps anti-biotine
- biotine fixée à un anticorps qui reconnait protéine d’intérêt sur puce
- allongement de l’oligonuléotide de l’anticorps via l’ADN circulaire modèle par une ADN polymérase
- hybridation de l’oligonucléotide avec courts oligonucléotides fluorescents qui apportent de très nombreux fluorophores
- augmente la sensibilité de la détection
Inconvénients :
- limité par la catalyse enzymatique
- calculer les rapports pour déterminer concentration des réactifs à ajouter
Radioactivité
Principe ?
Application ?
Molécules marquées au 32P, 33P ou au 14C.
Permet de détecter les évènements de phosphorylation de protéine et d’acétylation.
Utilisation de micropuits pour faire l’étude des activités enzymatiques :
- met les protéines substrats dans les puits avec des kinases par exemple
- si kinase reconnait la protéine, incorporation de la radioactivité
- lavage
- si puits avec radioactivité = protéines phosphorées avec kinase
Application : élaboration réseau global de protéines pouvant être phosphorylé
Résonance Plasmonique de Surface
Principe ?
Application ?
- faisceau de lumière polarisée monochromatique illumine une interface entre 2 milieux d’indice de réfraction différent
- l’angle d’incidence est tel que toute la lumière incidente peut être réfléchie (pas de réfraction)
- changements de masse, induit par l’association ou la dissociation des complexes avec les agents de capture fixés sur la lame, modifient l’indice de réfraction du milieu et décalent la position de l’angle de résonance
Application :
- caractériser interaction
Microscopie à Force Atomique
Principe ?
Application ?
Détection de la fixation d’anti-IgG de lapin immobilisées sur une surface d’or par mesure de l’augmentation de hauteur.
Application :
- Détecter la présence de pathogènes : anticorps fixé à la puce. Si fixation par pathogène, élévation de la hauteur du spot.
Spectrométrie de masse
Principe ?
Application ?
Analyse des masses des protéines capturées sur la puce.
Application :
- comparaison urine avant et après traitement
