Proteine Flashcards
Was ist der isoelektrische Punkt?
Der isoelektrische Punkt, kurz pI, ist ein exakt definierter pH-Wert einer wässrigen Lösung, bei dem sich bei Ampholyten oder Zwitterionen (z.B. Aminosäuren und Proteine) die positive und negative Ladung ausgleicht.
Was machen Peptidbindungen (Amidbindungen) aus?
- Doppelbindungscharakter
- keine freie Rotation
Welche Arten von Isomerie gibt es?
- Konstitutionsisomerie (Selbe Strukturformel, anderer Aufbau)
- Stereoisomerie
- Konformationsisomerie
- Konfigurationsisomerie
- Diastereomerie
- Enantiomerie
Was macht die Primärsequenz aus?
- Sequenz: Abfolge der AS + alle kovalenten Bindungen, sowie PTMs
- Disulfidbrücken (über Cystein ausgebildet)
- PTMs -> AS mit Hydroxgruppen als Target für Kinasen für Phosphorylierung
- physiko-chemische Eigenschaften -> Molekulargewicht, Extinktionskoeffizient, isoelektrischer Punkt, Hydrophobizität
- Strukturelemente (Helices, Turns, usw.)
- Stabilität des Proteins
- Lokalisation des Proteins (Signalsequenz, Nucleus-Lokalisierungssequenz, Export Signal
- Funktion des Proteins / Domänen (Homologien in Domänen und zu anderen Domänen durch Primärstrukturvergleich)
PTM: Prenylierung
Funtion:
- Membranverankerung
Modifizierte AS:
- Cystein
Beteiligten Enzyme:
- Farnesyltranferase
PTM: Glykolisierung
Funtion:
- Erhöhung der Löslichkeit und Stabilität
- Zelladhäsion
Modifizierte AS:
- Asparagin: N-Verknüpfung
- Serin und Threonin: O-Verknüpfung
Beteiligten Enzyme:
- Glykosyltranferase
PTM: Disulfidbrücken
Funtion:
- Quervernetzungen: Stabilität und Schutz vor Degradierung
- v. a. sekretorische Proteine
Modifizierte AS:
- Cystein
Beteiligten Enzyme:
- Proteindisulfidisomerase
PTM: Phosphorylierung
Funtion:
- Konformationsänderungen: intramolekularer Effekt
- Regulation von Proteininteraktionen: intermolekularer Effekt
Modifizierte AS:
- Serin
- Threonin
- Tyrosin
- Histidin
Beteiligten Enzyme:
- Proteinkinase: Phosphorylierung
- Phosphatase: Dephosphorylierung
PTM: Hydroxylierung
Funtion:
- Ausgangspunkt für Glykolisierung
- im Kollagen auch für Quervernetzung
Modifizierte AS:
- Lysin
- Prolin
Beteiligten Enzyme:
- Hydroxylase
PTM: Methylierung
Funtion:
- z.B. DNA-Methylierung: Schutz vor Fremder DNA, Fehlerkorrektu bei der DNA-Synthese, Markierung aktiver Bereiche
Modifizierte AS:
- Glutamat
- Arginin
- Lysin
Beteiligten Enzyme:
- Methyltransferase
PTM: Ubiquintinierung
Funtion:
- Oft Signal für Proteinabbau
Modifizierte AS:
- Lysin
Beteiligten Enzyme:
- Ubiquintin-aktivierendes Enzym
PTM: Acetylierung
Funtion:
- Regulationsmechanismus für die Funktion des Proteins
Modifizierte AS:
- Lysin
Beteiligten Enzyme:
- Histonacetylase
- Histoacetyltransferase
Warum falten sich Proteine?
Der hydrophobe Effekt ist die treibende Kraft der Proteinfaltung
Framework Modell
Hierarchische Faltung:
1. Lokale Sekundärstrukturen -> bestimmte AS-Sequenzen falten freiwillig zu a-Helices und B-sheets
2. Supersekundärstrukturen -> aufgrund energetischer Vorteile + größere Lebensdauer -> größere Wkeit der WW mit Nachbarstrukturen
3. Domänen
4. Tertiärstruktur
Hydrophober Kollaps
Durch WW zwischen unpolaren Resten -> Faltung durch spontanen Kollaps
-> molten globule: kann hohen Gehalt an Sekundärstrukturen besitzen
-> Viele AS-Ketten noch nicht fixiert
Sekundärstruktur: a-Helices
- Aminosäurekette helikal um imaginäre Achse gewunden Wechselwirkungen parallel zur Helixachse in Form von Wasserstoffbrückenbindungen des Polypeptidrückgrades Carbonyl von Rest i mit Amid von Rest i+4 bildet eine WBB
- Optimal ausgebildet wird interne WBB ausgebildet, folglich bildet jede Peptidbindung eine WBB
- Reste zeigen nach außen
- 3.6 AS pro Windung
- meistens rechtsgängige Helix
- Ganghöhe 5,4 A
- Makrodipol: positiv: Aminoterminal, negativ: Carboxyterminal ➔ Dipolmomente der Carboxy- und Amino-Gruppen addieren sich auf (jeweils immer in die gleiche Richtung orientiert!) ➔ Oft: Bindung von Ionen
Sekundärstruktur: B-Faltblätter
- bei β-Faltblättern lagern sich Abschnitte der Polypeptidkette in nahezu komplett ausgestreckter Konformation nebeneinander an dabei bilden sich WBB zwischen Carbonylsauerstoff und Amidstickstoff der Polypeptidkette aus
- Reste zeigen alternierend nach in andere Richtung
Bestimmte Reste bevorzugen bestimmte Sekundärstrukturelemente
- β-verzweigte Reste (Val, Ile, Thr) destabilisieren α-Helices (sterische Hinderung)
- β-verzweigte Reste passen gut in β-Faltblätter
- Ser, Asn, Asp kompetitieren um H-Brücken zu NH, C=O in α-Helices
- Pro: kein NH; interferiert mit β-Sheet und α-Helix (ok am N-terminus einer α-Helix)
- Gly: eher in flexiblen Bereichen
Tertiärstruktur
Globales 3D Arrangement der Polypeptidkette
- vollständige Faltung
- Konformation der Sekundärstrukturen zueinander
- Einberechnung:
o Interaktionen der Seitenketten
o Effekte, die über große Entfernungen wirken, wie WBB, hydrophobe Interaktionen etc.
- Ausbildung von Domänen (lokale Faltungsmotive); eine Domäne ist eine unabhängige Faltungseinheit im Protein (separater hydrophober Kern)
Quartiärstruktur
Anordnung von Proteinuntereinheiten in dreidimensionalen Komplexen
- Zwei oder mehr Polypeptidketten assoziiert
- Homo- oder heteromer
- permanent oder fakultativ
- Baustein = Untereinheit
- Wiederholungseinheit = Protomer
Was sind Chaperone und Chaporine?
Protein besitzt in Primärstruktur intrinsische Informationen für richtige native Faltung
- Chaperone verhindern, dass sich hydrophobe Bereiche eines Proteins zusammenlagern
➔ Chaperone interagieren mit partiell gefalteten/ falsch gefalteten Proteinen, um sie auf den „richtigen Faltungsweg zu bringen“
➔ Bereitstellung einer Mikroumgebung, in der die Faltung erleichtert ablaufen kann.
➔ Diese wird stetig verändert durch Nukleotidaustauschereignisse - keine aktive Faltungsförderung: Verhinderung der Zusammenballung ungefalteter Peptide
- erlauben wiederholte Faltungsversuche
- Missfaltung kann nicht revidiert werden
- Chaperorine (GroEL/ GroES) = Chaperone (DnaJ/K) bloß komplexer
Wirkungsprinzipien von Chaperonen und Chaporinen.
- Bilden abgeschlossenen Raum mit einer Mikroumgebung für Faltung
- Besitzen ATP binding side und ATPase Fähigkeit
→ Je nach gebundenem Nucleotid: verschiedene Affinitäten zu hydrophoben Bereichen durch Konformationsänderungen - ATP-Hydrolyse ist zeitintensiv
→ Faltungszeit für das Protein + Regulation durch Co-Chaperone und Nukleotidaustauschfaktoren
Ablauf vom DnaJ/K (Hsp40/Hsp70) Modell
- DnaJ bindet an ungefaltetes oder partiell ungefaltetes Protein, dann an DnaK-ATP
- ATP-Hydrolyse durch DnaK: stimuliert durch DnaJ ➔ DnaK-ADP hat hohe Affinität zu hydrophoben Bereichen des ungefalteten Proteins
- Bakterien: Nukleotidaustauschfaktor GrpE stimuliert Freisetzung von ADP
- ATP bindet an DnaK und Protein kann dissoziieren
- Wenn immer noch nicht im nativen Zustand: Wiederholung des Zyklus/Weiterleitung an GroEL System
Ablauf vom GroEL/GroES (hsp60/Hsp10) Modell
- Ungefaltetes Protein bindet an GroEL Bindetasche, die nicht von GroES blockiert wird
- ATP bindet an beide GroEL UEs
- ATP-Hydrolyse ➔ Freisetzung von ADP und GroES
- ATP & GroES binden an mit Protein gefülltes GroEL
- Faltung des Proteins im Chaperon-umschlossenen Raum
- Freisetzung des gefalteten Proteins nach wiederholter Dissoziation von GroES
- Wenn Protein nicht gefaltet ist: Wiederholung des Zyklus
Ramachandranplot Plot
- Rotationsfreiheitsgrade um formal frei drehbare Einzelbindungen im Polypeptidrückgrat ist sterisch jedoch eingeschränkt; wird durch Torsionswinkel angeben - Phi (Ф) und Psi (Ψ) geben die Rotation um die N-Cα (Ф) und Cα-CO (Ψ) Bindung des Polypeptidrückgrats an - Torsionswinkel abhängig von den beiden längsten Substituenten (fortlaufende Polypeptidkette)
➔ nicht alle Phi (Ф)/Psi (Ψ)-Kombinationen sind energetisch günstig
➔ Organisationsprinzip: sterischer Ausschluss
➔ dargestellt im Ramachandranplot - Plot ist AS-spezifisch; Asymmetrie beruht auf L-AS
Analytik – UV/Vis-Spektroskopie
Aminosäuren mit aromatischen Seitenketten absorbieren Licht in einem Bereich um 280 nm (UV-Absorption)
Tryptophan, Tyrosin, Phenylalanin, (Histidin)
Nur Tryptophan und Tyrosin praktisch nutzbar
Durch konjugiertes pi-System können elektronische Übergänge durch Licht im UV-Bereich leicht angerecht werden
Größenausschlusschromatogaphie
Mobile Phase:
- gepufferte Proteinlösung
Stationäre Phase:
- poröses Polymerharz
- Keine chemische Interaktion mit Proteinen
Eigenschaft der Auftrennung:
- Molekülgröße
Anwendung:
- Annähernd globuläre Proteine
-> Kleine Moleküle dringen eher in die Poren ein und werden langsamer eluiert
-> große Moleküle dringen schwerer in Poren ein und werden schneller eluiert
Elution:
- Pufferlösung
Vorgehensweise:
1. Standardproteine über Säule laufen lassen, von denen Molekulargewicht bekannt ist und gegen Elutionsvolumen auf tragen (log Mol.weight)
- Protein of interest (POI) über Säule laufen lassen und Molekulargewicht nach Elutionsvolumen von Gerade ablesen
Annahmen (Teilfrage in möglicher Klausurfrage):
globuläres Protein
keine chemische Interaktion mit Säule
Ionenaustauschchromatographie
Mobile Phase:
- gepufferte Proteinlösung
Stationäre Phase:
- Polymerharz mit negativ oder positiv geladenen Gruppen (fester Ionenaustauscher)
Eigenschaft der Auftrennung:
- Elektrische Nettoladung
Anwendung:
- Proteine mit unterschiedlichen elektrostatischem Oberflächenpotential
-> Proteine mit überwiegend entgegengesetzter Ladung zum Polymer gebunden
-> Proteine mit überwiegend gleicher Ladung weniger zurückgehalten
Elution:
- Salzlösung -> Konkurrenz
- pH-Wert-Änderung (verändert Ladung des Proteins)
Vorgehensweise:
Affinitätschromatographie
Mobile Phase:
- Proteinlösung
Stationäre Phase:
- Polymerharz mit gebundenen Liganden (Für jeden Analyten spezifische chemische Verbindung)
Eigenschaft der Auftrennung:
- Wechselwirkung zwischen Protein und Ligand
- Nicht-Kovalente-WW
Anwendung:
- Preoteine mit bekannten und spezifischen Liganden
Elution:
- Ligand in Lösung mit hoher Salzkonzentration
Vorgehensweise:
Enzyme
➔ Katalysieren Hin- & Rückreaktion durch das Aufbringen der Bindungsenergie, welche den Übergangszustand stabilisiert und damit die freie Enthalpie herab setzt
➔ dazu gehen sie Komplexe mit dem Substrat und auch dem Produkt ein. Ist ein Substrat gebunden, stellen Enzyme im aktiven Zentrum eine Bindungslandschaft dar, die komplementär zum Übergangszustand ist! Damit bezahlt es die ungünstige freie Enthalpie des Übergangszustandes mit Bindungsenergie
➔ Passfähigkeit ist nicht komplementär zum Substrat/ Produkt-Grundzustand
→ stellen die Gleichgewichtsreaktion schneller ein; können die Gleichgewichtslage aber nicht verändern!!
→ Bioreaktionen laufen bei moderaten Temperaturen, pH-Wert und im wässrigen Milieu ab
→ hohe Spezifität zum Substrat
→ gehen unverändert aus der Reaktion hervor → können mit anderen Reaktionen gekoppelt sein (z.B. ATP-Hydrolyse) um endergone Reaktionen ablaufen zu lassen
Substratspezifität
Nur mit einem bestimmten Metaboliten
Stereospezifität
Nur eines von zwei Enantiomeren
Wirkungsspezifität
Nur eine chemische Reaktion
Was bewirkt die Nutzung der Bindungsenergie
- Stabilisierung des Übergangszustandes
- Einführung sterischer Spannung im Substrat
- Stabilisierung instabiler Intermediate (z.B. getrennte Ladungen)
- Kompensation des Entropieverlustes bei mehr als einem Substrat (richtige Ausrichtung im Aktivzentrum)
- Desolvatisierung des Substrates (kostet Energie)
Enzym komplementär zum Substrat
- Ist das Enzym komplementär zum Substrat spricht man von einem Antienzym, da der Grundzustand der Substrate energetisch stabilisiert wird
- da sich der Übergangszustand energetisch aber noch auf demselben Niveau befindet, muss man noch mehr Aktivierungsenergie aufgewendet werden, um die Reaktionen ablaufen lassen zu können -> noch langsamer als unkatalysiert
