Processos downstream:

Question 1

Relação com impurezas e vírus envelopados vs não envelopados

Answer 1

• Envelopados: não lisam as células, saem por budding, criando menos impurezas; título mais baixo; mais sensíveis.
• Não envelopados: normalmente lisam as células libertando impurezas elevadas (como DNA e HCP, Host-Cell Proteins); mais fáceis de filtrar a 0.22um

Question 2

Passos nos processos downstream:

Answer 2

1. Clarificação (separar o solúvel do não solúvel): centrifugação, filtração profunda, filtração de fluxo normal ou tangencial
2. Cromotografia (purificação)
3. Concentração e troca de buffer
4. Filtração estéril: filtração de fluxo normal

Question 3

Tipos de impurezas:

Answer 3

• Relacionadas com o produto: variantes do produto (agregados, fragmentos, espécies deaminadas ou oxidadas)
• Relacionadas com o processo: regentes, materiais
• Contaminantes: materiais que não faziam parte do processo de produção (agentes microbianos, endotoxinas, micoplasma, etc)

Question 4

DNA hospedeiro é um grande impureza que leva ao aumento da:

Answer 4

Viscosidade
- devido à forte carga negativa do DNA, interage com os vírus e as proteínas, sendo difícil de separar e retirar o DNA

Question 5

Como é que HCPs interferem com o produto final:

Answer 5

• Podem desencadear uma resposta imune elevada no paciente e serem biologicamente ativas (não esquecer que podem ser proteínas de bactérias se estas forem o sistema de produção)
• Interferem com a estabilidade do produto de interesse, levando à sua perda de atividade ou até degradação

Question 6

Implicações dos processos upstream nos processos downstream:

Answer 6

O processo de purificação é completamente diferente consoante temos uma cultura aderente ou uma cultura em suspensão. Se fazemos a recolha as 8h ou as 20h, aquilo que vamos ter no bulk também é diferente (mais tarde já podemos ter DNA das células hospedeiras, p.e.). Usar soro ou não também tem implicações, porque remover as proteínas do soro é muito mais complicado durante a purificação. O tipo de cultura de célula: o facto de termos uma transfeção transiente (é preciso arranjar forma de remover esse DNA, para além do DNA das células hospedeiras) ou uma linha celular estável.

Question 7

Exemplo de nuclease para degradar DNA das células hospedeiras:

Answer 7

Benzonase

Question 8

Método tradicional de purificação de vírus:

Answer 8

Ultracentrifugação num gradiente de densidade (de sucrose, por exemplo)
* componentes separam-se consoante a sua densidade (difficult to scale-up)

Question 9

Diferentes tipos de cromatografia:

Answer 9

• por afinidade: reconhecimento de ligandos específicos (alta seletividade mas cara)
• por afinidade de um ião de metal
• de troca iónica: tendo em conta as cargas (escalável, barato e separar muitas coisas em conjunto, mas requer purificação tbm para DNA)
• exclusão de tamanho
• por interações hidrofóbicas

Question 10

Diferentes modos de operação da cromatografia:

Answer 10

• Bind and elute: produto liga-se
• Flow-through: impurezas é que se ligam

Question 11

Filtração de fluxo normal vs tangencial

Answer 11

• Normal: líquido pressionado perpendicularmente contra a membrana, fazendo o produto passar.
• Tangencial: liquido passa paralelamente à membrana (fluxo varre a superficie da membrana)

Question 12

Quando se utiliza a filtração de fluxo tangencial:

Answer 12

• para concentrar o produto
• trocar o tampão do produto

Question 13

Vantagem da filtração por fluxo tangencial em comparação com o fluxo normal:

Answer 13

Minimiza a obstrução dos poros e a incrustação na superfície por elementos retidos que não cabem nos poros, como acontece no fluxo normal.

Question 14

Na filtração de fluxo tangencial o tamanho do poro da membrana tem que ser mais ________________ do que o tamanho do produto que queremos concentrar

Answer 14

Baixo

Question 15

Poros mais largos vs poros mais estreitos:

Answer 15

• Largos - favorecimento do fluxo, mas com perda de vetores
• Estreitos - fluxo mais lento mas maior recuperação de vetores

Question 16

Desvantagens dos processos tradicionais de purificação (centrifugação em gradiente de concentração e ultracentrifugação em sucrose)?

Answer 16

• demorosos
• dificilmente escaláveis

Question 17

Range dos poros em:
* microfiltração:
* ultrafiltração:
* nanofiltração:

Answer 17

• 0.1 - 5 um
• 20nm - 0.1 um
• » 1 nm

Question 18

Desvantagem da cromatografia:

Answer 18

Recuperação baixa - requer optimização

Question 19

Cromatografia é muito usada em:

Answer 19

Purificação de vetores virais.

Question 20

Na TFF, o produto desejado fica no fluido __________ e as impurezas no _________

Answer 20

*produto - retido
* impurezas - filtrado

Question 21

Benefícios de TFF:

Answer 21

• taxas de recuperação do produto elevada
• rápido e com um custo adequado para a eficiência do produto
• robusto
• reproduzível
• escalável

Question 22

Adicionar ________ para aumentar a viscosidade e proteger vetores virais envelopados

Answer 22

Sucrose

Question 23

Principais desafios no desenvolvimento dos processos downstream:

Answer 23

• estabilidade do produto final
• respeitar a regulamentação e obter a pureza desejada
• velocidade de chegar ao mercado

Question 24

Diferenças entre impurezas e contaminantes:

Answer 24

As impurezas advêm do produto (proteínas ou DNA da célula hospedeiro) ou do processo (reagentes, proteínas de soro), enquanto que contaminantes são algo exterior (microorganismos)

Question 25

Principal vantagem da cromatina de afinidade:

Answer 25

Seletividade elevada

Question 26

O que ter em consideração se ocorre lise celular:

Answer 26

• vai ser preciso maior concentração de nuclease
• solução tampão para prevenir a agregação dos vetores virais com HCP e HCDNA (rico em sais)
• uma primeira filtração com um poro mais largo (20 a 5 um) para separar as células de restos celulares e uma segunda filtração com um poro mais estreito (para separar das outras impurezas)