Processamento e apresentação antigénica

Question 1

Ativação “não convencional” de linfócitos T

Answer 1

• Ativação policlonal de linfócitos T por superantigénios

- Reconhecimento de aloantigénios por linfócitos T

Question 2

Ativação policlonal de linfócitos T por superantigénios

Answer 2

Contribuem para a patogenicidade de alguns
microrganismos

Bypass do processo de
processamento antigénico

Crosslinking do MHC e TCR

Ativação não específica de LT,
associada com hiperativação
destas células

Conventional microbial T cell antigens, composed of a peptide bound to the peptide-binding groove of an MHC molecule, are recognized by a very small fraction of T cells in any one individual, and only these T cells are activated to become effector T cells that protect against the microbe.
=> Activation of peptide X specific T cell clones only; protective immunity

In contrast, a superantigen binds to class II MHC molecules outside the peptidebinding groove and simultaneously binds to the variable region of many different TCR β chains, regardless of the peptide
specificity of the TCR. Different superantigens bind to TCRs of different Vβ families. Because many T cells express a TCR β chain from a particular Vβ family, superantigens can activate a large number of T cells. In the example shown, the superantigen staphylococcal enterotoxin B (SEB) binds to HLA-DR and the V regions of TCRs belonging to the Vβ3 family. => polyclonal activation of Vbeta3+ T cells: cytokine storm and deletion of T cells

Question 3

Reconhecimento de aloantigénios por linfócitos T

Answer 3

Uma elevada frequência de linfócitos T são aloreactivos e estão envolvidos na rejeição de transplantes.

Direct and indirect alloantigen recognition:

Direct alloantigen recognition occurs when T cells bind directly to an intact allogeneic MHC molecule on a graft (donor) antigen-presenting cell (APC). => T cell recognizes unprocessed allogeneic MHC molecule on graft APC

Indirect alloantigen recognition occurs when allogeneic MHC molecules from graft cells are taken up and processed by recipient
APCs and peptide fragments of the allogeneic MHC molecules containing polymorphic amino acid residues are bound and presented by recipient (self) MHC molecules. => Presentation of processed peptide of allogeneic MHC molecule bound to self MHC molecule

Question 4

Reação mista linfocitária (MLR)

Answer 4

A rejeição de transplantes in
vivo é mediada por linfócitos T

A correlação in vitro da rejeição de transplantes é a designada por MLR

-> permite avaliar a resposta
de LT aloreativos a moléculas de MHC estranhas

-> é usado como teste
predicativo de rejeição de enxertos por LT

In a one-way primary MLR, stimulator cells (from donor Y) activate and cause the expansion of two types of
responder T cells (from donor X).

CD4+ T cells from donor X react to donor Y class II molecules, and CD8+ T lymphocytes from donor X react to donor Y class I MHC molecules.

The CD4+ T cells differentiate into cytokinesecreting helper T cells, and the CD8+ T cells differentiate into CTLs that lyse the target cell.

Question 5

Características da ligação do péptido à molécula de MHC

Answer 5

Broad specificity => many different peptides can bind to the same MHC molecule

Each MHC molecule displays one peptide at a time => Each T cell responds to a single peptide bound to an MHC molecule

MHC molecules bind only peptides => MHC-restricted T cells respond mainly to protein antigens

Peptides are acquired during intracellular assembly => Class I and class II MHC molecules display peptides from different cellular compartments

Stable surface expression of MHC molecule requires bound peptide => only peptide-loaded MHC molecules are expressed on the cell surface for recognition by T cells

Very slow off-rate => MHC molecule displays bound peptide for long enough to be located by T cell

Question 6

Processamento e apresentação antigénica

Answer 6

As moléculas de MHC são capazes de apresentar péptidos mas não proteínas microbianas intactas.

Os mecanismos que convertem proteínas em péptidos capazes de se ligarem a moléculas de MHC são designados por processamento antigénico.

Question 7

Necessidade de processamento antigénico para a ativação de células T

Answer 7

APC fixadas antes de
exposição ao Ag: -

APC fixadas depois
de exposição ao Ag: +

APC fixadas antes de exposição ao Ag, mas expostas a Ag processado: +

Question 8

Visão global de processamento de Ag para carregamento em moléculas de MHC classe I e II

Answer 8

Há duas vias de processamento de Ag e apresentação, que diferem na fonte de Ag, tráfego intracelular e associação a moléculas de MHC.

• Ag intracelulares são apresentados em moléculas de MHC I a células T CD8+.
• Ag extracelulares são apresentados em moléculas de MHC II a células T CD4+.

The class II MHC pathway converts protein antigens that are endocytosed into vesicles of antigenpresenting cells into peptides that bind to class II MHC molecules for recognition by CD4+ T cells: endocytosis of extracellular protein –> endosome/lysosome –> merge with vesicle from ER with class II MHC and invariant chain –>…

The class I MHC pathway converts proteins in the cytosol into peptides that bind to class I MHC molecules for recognition by CD8+ T cells:
cytosolic protein --> proteasome --> peptides in cytosol --> TAP, transporter associated with antigen processing, into ER with Class I MHC  --> vesicle --> ...

Question 9

Processamento de Ag para apresentação por moléculas de MHC classe I

Answer 9

1. Aquisição de Ag - infeção
2. Proteólise -> degradação por proteassomas no citosol
3. Transporte de péptidos do citosol para o ER para carregamento em moléculas de MHC I -> Transporte mediado por TAP
4. Carregamento de péptidos em moléculas de MHC I
5. Expressão de complexos MHC/péptido à superfície celular

Figure depicts proteasomal proteolysis of a (ubiquitinated) protein synthesized within the cell or that is ingested into a phagosome and then transported into the cytosol.

Presentation of ingested proteins by class I MHC molecules is the basis of cross presentation.

TAP, tapasin, chaperone, beta2m…

ERAP, Endoplasmic reticulum associated peptidase;
β2m, β2-microglobulin; TAP, transporter associated with antigen processing

Question 10

Como é que são originados os péptidos para carregamento em MHC I?

Answer 10

As proteínas citosólicas são degradadas em estruturas

cilíndricas designadas por PROTEASSOMAS

Question 11

A molécula de MHC I é sintetizada no RE. Como entra em contacto com péptidos gerados no citosol?

Answer 11

Domínio hidrofóbico & domínio de ligação a ATP:

TAP1 and TAP2 are individual polypeptide chains, each with one hydrophobic and one ATP-binding domain. The two chains assemble into a heterodimer to form a four-domain transporter typical of the ATP-binding cassette (ABC) family. The hydrophobic transmembrane domains have multiple transmembrane regions (not shown here). The ATP-binding domains lie within the cytosol, whereas the hydrophobic domains project through the membrane into the lumen of the endoplasmic reticulum (ER) to form a channel through which peptides can pass.

Question 12

Processamento antigénico para carregamento em MHC I - com mais detalhes

Answer 12

• PLC (Peptide-loading complex): calreticulina, tapasina, TAP, Erp57 e MHC I
• ERAAP (Endoplasmic reticulum aminopeptidase associated with antigen processing): aminopeptidase que cliva péptidos no N-terminal, permiting que péptidos demasiado longos possam ser carregados em MHC I

Newly synthesized MHC class I alfa chains assemble in the endoplasmic reticulum (ER) with the membrane-bound protein calnexin. When this complex binds β2-microglobulin (β2m), the MHC class I α:β2m dimer dissociates from calnexin, and the partly folded MHC class I molecule then binds to the TAPassociated protein tapasin. Two MHC:tapasin complexes may bind with the TAP dimer at the same time.

The chaperone molecules ERp57, which forms a heterodimer with tapasin, and calreticulin also bind to form the MHC class I peptide-loading complex.

The MHC class I molecule is retained within the ER until released by the binding of a peptide, which completes the folding of the MHC molecule.

Even in the absence of infection, there is a continual flow of peptides from the cytosol into the ER.

Defective ribosomal products (DRiPs) and proteins marked for destruction by K48-linked polyubiquitin are degraded in the cytoplasm by the proteasome to generate peptides that are transported into the lumen of the ER by
TAP. Some of these peptides will bind to MHC class I molecules. 

The aminopeptidase ERAAP trims the peptides at their amino termini, allowing peptides that are too long to bind to MHC class I molecules and thereby increasing the repertoire of potential peptides for presentation.

Once a peptide has bound
to the MHC molecule, the peptide:MHC complex leaves the endoplasmic reticulum and is transported through the Golgi apparatus and finally to the cell surface.

Question 13

Membros da familia herpesvírus interferem com o processamento antigénico para MHC I

Answer 13

Herpesvírus codificam uma
grande variedade de proteínas que interferem com a apresentação antigénica para carregamento em moléculas de MHC I de modo a impedir eliminação de células infectadas por CTL

O slide representa o processamento antigénico que ocorre numa célula para carregamento em MHC I, assim como diferentes proteínas expressas por membros da família herpesviridae capazes de interferir com este processamento.

Para a célula ser eliminada por CTLs é necessário que na célula alvo péptidos virais sejam carregados em moléculas de MHC classe I.

Membros desta família de vírus codificam uma grande variedade de proteínas que interferem com múltiplas fases do processamento antigénico para carregamento em MHC I. Por exemplo, a proteína EBNA1 de EBV inibe a atividade do proteossoma. Desta forma, vírus desta família conseguem escapar à atividade mediada por CTLs.

Tumores que também são alvo de CTLs, conseguem escapar à ação mediada por estas células, via inibição de expressão de MHC I. Se uma célula “alvo” não apresenta MHC I à superfície ou no caso de células infetadas por vírus não apresenta péptidos virais no contexto de MHC I, a mesma escapa à atividade de CTLs (a CTL para ser ativada e exercer a sua função citotóxica tem que reconhecer o seu péptido específico no contexto de MHC I).

!!Ver imagem - é preciso saber todos??

Question 14

Processamento de Ag para apresentação por MHC classe II - passos gerais

Answer 14

1. Aquisição de Ag– macropinocitose, fagocitose, endocitose mediada por recetores (endocitose mediada por clatrina)
2. Endereçamento para o compartimento endocítico – pH acídico
3. Proteólise -> degradação por proteases
4. Carregamento de péptidos na molécula de MHC II (troca com CLIP)
5. Expressão na superfície cellular – constitutiva e indutível (IFN gama)

Protein antigens are ingested by antigen-presenting cells (APCs) into vesicles, where they are degraded into peptides. Class II MHC molecules enter the same vesicles, where the class II invariant chain peptide (CLIP) that occupies the cleft of newly synthesized class II molecules is removed. These class II molecules are then able to bind peptides derived from the endocytosed protein. The DM molecule facilitates the removal of CLIP and subsequent binding of the antigenic peptide. The peptide–class II MHC complexes are transported to the cell surface and are recognized by CD4+ T cells

CLIP, class II–associated invariant chain peptide; Ii, invariant chain.

Question 15

Apresentação de Ag via MHC classe II

Answer 15

-Patogénios que residem no interior de vesículas ou antigénios extracelulares que são internalizados pelas APCs.

Antigen is taken up from the extracellular space into intracellular vesicles –> in early endosomes of neutral pH, endosomal proteases are inactive –> acidification of vesicles activates proteases to degrade antigen into peptide fragments –> vesicles containing peptides fuse with vesicles containing MHC class II molecules

-Proteases acídicas envolvidas na degradação de antigénio: Catepsinas B, D, S e L

-Fagocitose ou endocitose de Ag extracelulares por APCs profissionais resulta no seu transporte através de uma série de vesículas intracelulares, com pH cada vez mais baixo, nas quais as proteínas são degradadas em péptidos. Estas vesículas fundem-se finalmente com vesículas contendo a molécula de MHC com origem no
RE.

-A ligação do MHC-II à “invariant chain” (Ii) impede o seu
carregamento com péptidos no RE
A “invariant chain” é clivada de forma a deixar um fragmento peptídico (CLIP) no “groove” da molécula de MHC II no RE

• Ii direciona a molécula de MHC-II para compartimentos acídicos onde se encontram com os péptidos resultantes de Ag extracelulares.

Question 16

HLA-DM

Answer 16

facilita o carregamento de péptidos em
moléculas de MHC II!!

First panel: the invariant chain (Ii) binds to newly synthesized MHC class II molecules and blocks peptides from binding class II molecules in the endoplasmic reticulum and during their transport to acidified endosomes.

Second panel: in late endosomes, proteases cleave the invariant chain, leaving CLIP bound to the MHC class II
molecules. 

Third panel: pathogens and their proteins are broken down into peptides within acidified endosomes,
but these peptides cannot bind to MHC class II molecules that are occupied by CLIP. 

Fourth panel: the class II-like molecule HLA-DM binds to MHC class II:CLIP complexes, catalyzing the release of CLIP and the binding of antigenic peptides.

Question 17

Ativação de DCs e expressão de MARCH-1

Answer 17

Ativação de DCs reduz expressão de MARCH-1
aumentando a semi-vida das moléculas de MHC II !!

in immature DCs, MARCH-1 ubiquitinates MHC molecules, targetting them for degradation –> activation stops transcription of the MARCH-1 gene, increasing the lifetime of MHC molecules –> MHC molecules accumulate on the cell surface, presenting peptides they acquired at the time of DC activation

Além de regular a expressão de MHC II, MARCH-1 também controla os níveis de expressão da molécula co-estimuladora CD86 em DCs –> ao chegar aos gânglios linfáticos, estas apresentam péptidos derivados dos patogénios em moléculas de MHC II e níveis elevados de expressão de CD86 para uma eficiente ativação de LT CD4+.

Before activation by innate recognition of pathogens, dendritic cells express the membrane-associated E3 ligase MARCH-1, which resides in the recycling endosomes compartment, where it attaches K-48-linked ubiquitin chains to the β chain of MHC class II molecules. This causes MHC molecules to move from the recycling endosomes and eventually to be degraded,
leading to a reduced overall half-life and level of MHC expression on the cell surface. 
Signals emanating from innate sensors, such as TLR-4, reduce the level of MARCH-1 mRNA, and with the half-life of MARCH-1 now being short, MHC molecules are free to accumulate on the cell surface. 
Because innate signaling also triggers acidification of endocytic compartments and activates caspases associated with antigen processing, the MHC molecules that accumulate on the cell surface will bear peptides from the pathogens captured around the time of innate activation of the dendritic cells.

Question 18

Apresentação cruzada: importância

Answer 18

• Qualquer célula nucleada pode ser infetada por vírus ou apresentar transformação neoplásica, assim o sistema imunológico tem que ser capaz de capaz de gerar respostas mediadas por CTLs específicas para
estes Ag virais or Ag de células neoplásicas.

• Apenas algumas APCs, primordialmente DCs, são capazes de promover ativação de linfócitos T naive.

• Como é que então antigénios expressos por células infetadas por vírus ou células neoplásicas (não apresentadoras de antigénio profissionais) são
“transferidas” para APCs?

Question 19

Apresentação cruzada - processo

Answer 19

Apresentação de antigénios extracelulares por moléculas MHC classe I a CTLs.

• Este processo explica como infeção de células não apresentadoras de antigénio levam à iniciação de uma resposta mediada por linfócitos T CD8+.

Infected cells and viral antigens picked up by host APCs –> ingested by DCs –> viral antigen enters cytosol and processed in proteasomes –> presented in association with class I MHC molecules = cross-presentation to CD8+ T cells –> T cell response

note that the same crosspresenting APCs may display MHC-associated antigens from the microbe for recognition by CD4+ helper T cells.

Question 20

Péptidos imunodominantes

Answer 20

• As restrições/limitações estruturais da ligação de um péptido a diferentes moléculas de MHC, incluindo o seu tamanho e resíduos âncora, são responsáveis pela imunodominância de alguns péptidos derivados de
antigénios proteícos complexos e pela incapacidade de alguns indivíduos em responder a determinados antigénios proteícos.

• Quando qualquer proteína é degradada numa APC, muitos péptidos podem ser gerados, mas apenas aqueles capazes de se ligar a moléculas de MHC do indivíduo são capazes de ser apresentados a linfócitos T. Estes péptidos com a propriedade de se ligarem ao MHC, e serem por isso apresentados e promoverem a ativação de linfócitos T, são os péptidos imunodominantes do antigénio.
• Os péptidos que desencadeiam uma resposta imunológica mais vigorosa após “priming” com um antigénio proteíco são denominados como dominantes, ao passo que péptidos que estimulam respostas imunológicas mais fracas são designados por subdominantes.
• Mesmo microrganismos com antigénios proteícos complexos expressam um número limitado de péptidos imunodominantes.

Question 21

determinant selection

Answer 21

MHC alleles select best binding peptides and thereby select which determinants will be immunogenic in an individual:

internalization of antigen with multiple peptide epitopes into n APC –> Antigen processing –> Processing generates multiple peptides, one of which can bind to class II allele –> T cells respond to immunodominant peptide epitope

Question 22

comparative features of the two major antigen processing pathways

Answer 22

Class II vs Class I MHC pathway

–Composition of stable peptide-MHC complex:
polymorphic alpha and beta chains of MHC, peptide
vs.
polymorphic alpha chain of MHC, beta2-microglobulin, peptide

–Cells that express that MHC:
DCs, mononuclear phagocytes, B lymphocytes, endothelial cells, thymic epithelium
vs.
all nucleated cells

–Responsive T cells:
CD4+ T cells
vs.
CD8+ T cells

–Source of protein antigens:
Endosomal/lysosomal proteins (mostly internalized from extracellular environment)
vs.
cytosolic proteins (mostly synthesized in the cell; may enter cytosol from phagosomes)

–Enzymes responsible for peptide generation:
endosomal and lysosomal protease (eg cathepsins)
vs.
enzymatic components of cytosolic proteasome

–Site of peptide loading of MHC:
late endosomes and lysosomes
vs.
ER

–Molecules involved in transport of peptides and loading of MHC molecules:
invariant chain, DM
vs.
TAP

Question 23

Conceitos chave

Answer 23

• Os recetores de Ag de células T a/b reconhecem péptidos apenas quando apresentados por moléculas de MHC. Linfócitos T auxiliares CD4+ reconhecem antigénios em associação com moléculas de MHC classe II expressos à superfície de APCs e linfócitos T citotóxicos CD8+ reconhecem antigénios em associação com moléculas de MHC classe I.

• APCs capturam antigénios proteícos, processam-nos e apresentam os péptidos resultantes no contexto de moléculas de MHC a linfócitos T. As DCs são as APCs mais eficientes na ativação de linfócitos T naive.
Macrófagos e linfócitos B apresentam antigénios a linfócitos T CD4+ auxiliares na fase efetora da imunidade celular e resposta humoral, respetivamente. Todas as células nucleadas são capazes de apresentar péptidos derivados de proteínas citosólicas, como antigénios virais e tumorais, em moléculas de MHC classe I a linfócitos T CD8+.

• As DCs capturam Ag de microrganismos no seu local de entrada (usualmente o epitélio) e transportam-nos para os orgãos linfoides secundários. Linfócitos T naive que recirculam nesses orgãos linfoides reconhecem os antigénios e são ativados. Assim, as respostas imunológicas adquiridas são iniciadas nestes orgãos.
• O MHC (major histocompatibility complex) é uma extensa região genética que codifica para moléculas de MHC classe I e classe 2 altamente polimórficas e expressas de forma co-dominante.
• As moléculas de MHC classe I são compostas por uma cadeia a associada não-covalentemente a um polipéptido não polimórfico desigando por β2- microglobulina. As moléculas de MHC classe II contém 2 cadeias polimórficas, a cadeia a e cadeia β, ambas codificadas pelo locus do MHC. Os resíduos polimórficos nas moléculas de MHC estão localizados no domínio de ligação ao péptido.

• A função das moléculas de MHC é apresentar péptidos a linfócitos T. Péptidos associados a MHC classe I são reconhecidos por linfócitos T CD8+ e péptidos associados a MHC classe II são reconhecidos por
linfócitos T CD4+. As moléculas de MHC apresentam apenas um péptido de cada vez, e todos os péptidos capazes de se ligar à mesma molécula de MHC compartilham motivos estruturais. Cada molécula de MHC tem uma ampla especificidade para ligação a péptidos e pode apresentar múltiplos péptidos que possuem características estruturais comuns, como os resíduos âncora.

• O local de ligação ao péptido (peptide-binding cleft) na molécula de MHC classe I pode acomodar péptidos de 6 a 16 aminoácidos (idealmente com 8 a 10 aminoácidos), ao passo que as moléculas de MHC classe II acomodam péptidos maiores (até 30 aminoácidos de tamanho ou mesmo maiores). Alguns resíduos polimórficos da molécula de MHC determinam a especificidade de ligação a péptidos, visto formarem estruturas designadas por bolso (“pockets”) que interagem com os resíduos âncora do péptido associado. Outros resíduos polimórficos do MHC e alguns resíduos do péptido formam a estrutura reconhecida pelos linfócitos T.
• As moléculas de MHC classe I são expressas em todas as células nucleadas, ao passo que moléculas de MHC classe II são expressas em APCs profissionais, como DCs, macrófagos e linfócitos B, e ainda em células epiteliais tímicas. A expressão de moléculas de MHC é aumentada por estímulos inflamatórios e particularmente por citocinas como IFN-γ, que estimula transcrição dos genes de MHC.

• O processamento antigénico equivale à conversão de proteínas nativas em péptidos capazes de ser apresentados em moléculas de MHC. Este
processo consiste na introdução de antigénios proteícos exógenos em vesículas de APCs ou na síntese de antigénios no citosol, na degradação proteolítica destas proteínas em péptidos, na ligação destes péptidos a moléculas de MHC e na sua apresentação à superfície da célula para reconhecimento por linfócitos T. Assim, tanto proteínas extracelulares como intracelulares são submetidas a vias de processamento antigénico, e os péptidos resultantes de proteínas endógenas e exógenas são apresentados em moléculas de MHC a LT.

• Para apresentação em moléculas de MHC classe I, os antigénios proteícos são degradados em proteassomas, dando origem a péptidos que se ligam a moléculas de MHC I. A maioria destes antigénios são sintetizados no citosol ou introduzidos no citosol por microrganismos ou vesículas. O transporte destes péptidos do citosol para o ER efetua-se via transportador desigando por TAP, num processo dependente de ATP.
• A cadeia recentemente sintetizada de MHC classe I ligada à β2- microglobulina, é associada ao complexo TAP e recebe péptidos transportados para o RE. Os complexos estáveis de moléculas de MHC classe I com péptidos associados desloca-se para fora do RE, através do Golgi, para a superfície da célula.
• Relativamente ao processamento antigénico para carregamento em MHC classe II, os antigénios proteícos são internalizados em endossomas, e clivados proteoliticamente por enzimas presentes em lisossomas e endossomas tardios. As moléculas recentemente sintetizadas de MHC classe II são associadas à invariant chain (Ii) e são transportadas do RE para o compartimento endossomal. Nestes a Ii é clivada proteoliticamente e o péptido remanescente (CLIP) que permanece associado ao local de ligação ao péptido (“peptide-binding cleft) na molécula de MHC classe II, é removido do mesmo pela ação da molécula HLA-DM. Os péptidos gerados a partir de proteínas extracelulares são então capazes de se ligar ao local de ligação ao péptido disponível, e o complexo (molécula de MHC e péptido) é expresso à superfície da célula.
• Estas vias de processamento antigénico asseguram que a maioria das células do corpo são testadas para a possível presença de Ag exógenos. Estas vias também garantem que proteínas de microrganismos extracelulares dão origem preferencialmente a péptidos para carregamento em moléculas de MHC classe II e reconhecimento por LT CD4+ auxiliares, que ativam mecanismos efetores para eliminação de antigénios extracelulares. Em contrapartida, proteínas derivadas de microrganismos intracelulares (citosólicos) dão origem a péptidos carregados em moléculas de MHC classe I para reconhecimento por LT CD8+ citotóxicos, cuja função é a eliminação das células que “hospedam” a infeção intracelular. A imunogenicidade de antigénios proteícos exógenos depende da capacidade das vias de processamento antigénico em originar péptidos derivados dos mesmos para carregamento em moléculas de MHC do próprio.