Hematopoiese e células do sistema imunológico

Question 1

Hematopoiese definição

Answer 1

=Processo de diferenciação e maturação celular de todas as populações celulares presentes no sangue (eritrócitos, leucócitos e plaquetas) a partir de células estaminais hematopoiéticas
pluripotentes (CEH).

Todos os componentes celulares do sistema imunológico (SI) derivam de CEH. No período pós-natal as CEH encontram-se na medula óssea.

ver imagem!

Nascimento: todos os ossos
A partir do 3º ano (??):
Esterno
Costelas
Vértebras
Bacia
Escápula
Porções proximais dos
úmeros e fémures

Question 2

Hematopoiese esquema

Answer 2

ver!!! [red blood marrow–> hematopoietic stem cells –> red blood cells, white blood cells, platelets]

CEH (pluripotentes) –> Progenitor linfoide (multipotente) –> T, DC; B, ILC (Populações linfoides, “unipotentes”)

e CEH–> Progenitor mieloide –> Neutrófilos, Monócitos, Macrófagos, DC, Eosinófilos, Basófilos, Mastócitos, Plaquetas, Eritrócitos (Populações Mieloides)

Progenitores não possuem
a capacidade de “autorenovação” (self-renewal) e estão “comprometidos”
com uma linhagem celular específica

Processo multi-passo para
a produção de um tipo de célula

Diversos fatores de transcrição desempenham um papel importante na hematopoiese (e.g. IKAROS é necessário para desenvolvimento linfóide; NOTCH necessário para decisão B/T).

Diversas citocinas também regulam a hematopoiese.

Question 3

Células sistema imunológico inato vs adquirido e suas linhagens

Answer 3

• Células sistema imunológico inato: neutrófilos, basófilos, eosinófilos, mastócitos,
monócitos, macrófagos, células dendríticas, células linfoides inatas (todas menos
as células linfóides inatas pertencem à linhagem mieloide)

• Células sistema imunológico adquirido: linfócitos B e T (células linhagem linfoide)

Question 4

Normal adult blood cell counts

Answer 4

Red blood cells - 5.0*10^6 (cells/mm^3)

Platelets - 2.5 * 10^5

Leucocytes - 7.3*10^3

• ->Neutrophil - 50-70%
• ->Lymphocyte - 20-40%
• ->Monocyte - 1-6%
• ->Eosinophil - 1-3%
• ->Basophil - <1%

Question 5

Fagócitos

Answer 5

• Os fagócitos, que incluem neutrófilos (polimorfonucleares) e macrófagos (mononucleares), têm como principal função ingerir e destruir microrganismos assim como eliminar células danificadas.

• A sua ação na resposta imunológica desenrola-se em passos sequenciais: recrutamento para os locais de infeção, reconhecimento de
microrganismos e ativação, ingestão de microrganismos por fagocitose e destruição dos microrganismos ingeridos.

• Macrófagos e neutrófilos partilham diversas características como capacidade de fagocitose, de migração para os tecidos via vasos sanguíneos e resposta quimiotática mas também apresentam muitas
diferenças.

Question 6

Granulócitos

Answer 6

neutrófilos, eosinófilos, basófilos e mastócitos

Grânulos contêm variedade de proteínas com funções distintas:

• Algumas causam diretamente dano em microrganismos;
• outras regulam o tráfego e a atividade de outros leucócitos, incluindo linfócitos;
• outras contribuem para a remodelação dos tecidos no local da infeção.

Question 7

Neutrófilos

Answer 7

• Neutrófilos ou leucócitos polimorfonucleares (núcleo
multiglobulado) ou granulócitos (grânulos presentes no citoplasma com atividade microbicida) são a população mais abundante de leucócitos no sangue (50-70%) e medeiam a fase inicial da resposta inflamatória (primeira população a chegar ao local de inflamação).

• Aumento do seu número é a primeira indicação de infeção.
• Possuem tempo de semi-vida muito curto (1 a 2 dias nos tecidos).
• Produção é estimulada por G-CSF (granulocyte colony-stimulating factor) e GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor).
• A sua principal função é fagocitar microrganismos e produtos de células necróticas e destruí-los em fagolisossomas.

• Deficiências em neutrófilos estão associadas a suscetibilidade aumentada
a infeções fúngicas e bacterianas.

• > Possuem 2 tipos de grânulos:
• específicos que contém enzimas como lisozima, colagenase e elastase;

-azurófilos que contém enzimas e outras substâncias microbicidas como defensinas e catelicidinas.

Question 8

Eosinófilos

Answer 8

• Papel em infeções por parasitas (grânulos contém enzimas nocivas para a sua parede celular, nomeadamente Proteína Básica Principal, MBP)
• GM-CSF, IL-3 e IL-5 promove a sua maturação a partir do precursor mieloide

H&E grânulos rosa

Question 9

Basófilos

Answer 9

• Granulócitos com similaridades estruturais e funcionais com mastócitos
• Desempenham um papel nas reações alérgicas
• Não possuem atividade fagocítica

H&E grânulos azul

Question 10

Mastócitos

Answer 10

• Presentes na pele e no epitélio das mucosas
• Desenvolvimento dependente do ligando de c-kit
• Possuem grânulos ricos em histamina e outros mediadores
• Desempenham um papel importante no desenvolvimento de alergias

Question 11

Fagócitos mononucleares

Monócitos/Macrófagos

Answer 11

• Monócitos circulam no sangue e migram para tecidos diferenciando-se em macrófagos.
• Diferenciação dependente de M-CSF (macrophage colony-stimulating factor.

• A principal função dos macrófagos na defesa do hospedeiro é ingerir e
matar microrganismos.

• Macrófagos também ingerem células mortas como parte do “mecanismo de limpeza” após infeção ou lesão de tecidos.
• Macrófagos podem funcionar como APC.
• Macrófagos promovem reparação de tecidos danificados estimulando angiogénese e síntese de matriz extracelular rica em colagénio (fibrose).
• Contrariamente a neutrófilos, podem dividir-se nos locais de infeção.
• População mais importante em estadios mais tardios da resposta imunológica inata.

Question 12

Maturação de monócitos e macrófagos

Answer 12

ver imagem!

-In the steady state in adults (homeostasis) and during inflammatory reactions, precursors in the bone marrow (Hematopoietic stem cell –> monocyte/dentritic cell precursor) give rise to circulating monocytes, which enter peripheral tissues, mature to form macrophages, and are activated locally.

-In early development, as in fetal life, precursors in the yolk sac and fetal liver (= fetal hematopoietic organs) give rise to cells that seed tissues (tissue macrophage precursor) to
generate specialized tissue-resident macrophages (microglial cells, Kuppfer cells, Alveolar macrophage, Sinusoidal macrophages).

A maioria dos macrófagos residentes nos tecidos diferenciam-se durante o desenvolvimento embrionário e têm a capacidade de se auto-renovarem (self-renewal).

Question 13

Monocyte vs Macrophage

Answer 13

ver imagem!!

Monocyte: Nucleus, Lysosome, Phagosome

Macrophage: Pseudopodia, Phagosomes, Lysosome, Phagolysosome

Question 14

Subtipos de monócitos

Answer 14

• Monócitos clássicos ou inflamatórios - produzem mediadores inflamatórios, são fagocíticos e rapidamente recrutados para locais de inflamação ou de lesão/insulto.

Em humanos: CD14hi CD16neg CCR2+

Em ratinho: Ly6hi CCR2+

• Monócitos não clássicos- recrutados para os tecidos após infeção ou lesão/insulto e podem contribuir para a reparação.

Em humanos: CD14low CD16hi CX3CR1

Em ratinho: Ly6clow

+Subset intermédio presente em humanos! (flow citometry…)

Question 15

Ativação dos subtipos de macrófagos

Answer 15

-Ativação clássica:
Pró-inflamatória!!

+IFN-gama, LPS –> M1 ativado
–> iNOS, TNF-alfa, IL-1, IL6, IL-12, IL-23, MCP-1, IFN-gama

M1 activation is associated with inflammation, tumor resistance, and graft rejection

-Ativação alternativa: Anti-inflamatória!!

+IL-4, IL-13 –> M2 ativado –> IL-10, Aginase1, CD206, CD204, TGF-beta1, VEGF, Ym1

M2 activation is associated with immunoregulation, matrix deposition, remodelling, and graft acceptance

!Citocinas são produzidas por LT auxiliares

Question 16

Células dendríticas

Answer 16

• Diferenciação dependente de Flt3L (Flt3 kinase receptor expresso no precursor).
• Possuem extensões membranares que lembram dendrites em neurónios.

• São as células apresentadoras de antigénio mais importantes na ativação de linfócitos T naïve.
-> Tiram um “snapshot” do que está acontecer nos tecidos durante a infeção e levam essa imagem para os gânglios linfáticos

• Desempenham um papel primordial na resposta inata a infeções e na “ligação” da resposta imunológica inata com a adquirida.

Question 17

Maturação de DCs

Answer 17

imagem!

DCs arise from a common precursor cell of the myeloid lineage in the bone marrow (Monocyte/DC precursor) and further differentiate into
subsets, the major ones being classical DCs and plasmacytoid DCs. Inflammatory DCs may arise from monocytes in inflamed tissues.

Question 18

Subtipos de DCs (geral)

Answer 18

• Clássicas ou convencionais-

• subtipo mais abundante está envolvido na captura de Ag proteícos de microrganismos que entram através do epitélio e na sua apresentação a LT nos gânglios.
• O outro subtipo (DCs com capacidade de apresentação cruzada) é especializado a apresentar Ag a Linfócitos T CD8+ e promover a sua diferenciação em CTL.

• Plasmacitoides- produzem IFN-I em resposta a virus e estão possivelmente envolvidas na captura de microrganismos que entram via corrente sanguínea e na apresentação dos seus Ag proteícos a LT no fígado.

Question 19

Human DC subsets
(major - cross-presenting - plasmacytoid dendritic cells)

(Surface markers, TLRs expressed, Transcription factors, Major cytokines produced, Major postulated functions)

Answer 19

(major - cross-presenting - plasmacytoid dendritic cells)

–SURFACE MARKERS–

CD11c, BDCA-1 (CD1c), Dectin1 (CLEC7A), Dectin2 (CLEC6)

CD11c, BDCA-3 (CD141) CLEC9A, XCR1+

BDCA-2 (CD303), BDCA4 (CD304), CD123

–TLRs EXPRESSED–

Various

Various

High levels of TLR7, TLR9

–TRANSCRIPTION FACTORS–

IRF4

IRF8

E2-2

–MAJOR CYTOKINES PRODUCED–

IL-12, others

IL-23

Type I IFN

–MAJOR POSTULATED FUNCTIONS–

Innate immunity: source of inflammatory cytokines; adaptive immunity: capture and presentation of antigens mostly to CD4+T cells

Adaptive immunity: capture and cross-presentation of Ag to CD8+ T cells

Antiviral immunity: early innate response; priming of antiviral T cells

Question 20

Linfócitos T e B

Answer 20

(células da linhagem linfóide)
- Imunidade adquirida

• 20-40% leucócitos no sangue periférico e 99% células na linfa
• Únicas células que expressam recetores de Ag (TCR e BCR), cada um com especificidade para um determinante antigénico diferente
• Células pequenas, com “pouco” citoplasma
• Linfócitos que ainda não interagiram com o seu antigénio (Ag) específico = naïve
• Interação com o Ag específico –> proliferação e diferenciação em células efetoras (e.g. plasmócitos) e células de memória

-> Num indivíduo adulto saudável:
5x10^11 linfócitos
~2% no sangue
~4% na pele
~10% medula óssea
~15% mucosas do trato intestinal e respiratório
~65% orgãos linfóides secundários (gânglios e baço)

Question 21

Células linfóides inatas (ILC)

Answer 21

(células da linhagem linfóide)
- Imunidade inata

• Células NK (Natural Killer; incluídas no Grupo 1 das ILCs) são representativas da população

Question 22

Linfócitos B

Answer 22

• Local de desenvolvimento/ maturação:

• Bursa de Fabricius nas aves
• Medula óssea em mamíferos
• Expressam BCR (“embebido” na membrana); quando secretado anticorpo (Ab)
• Cada LB expressa um BCR com especificidade única e cada LB expressa ~1.5–3×10^5 moléculas de BCR com locais de ligação ao Ag idênticos

[imagem: Fab, Fc, VL, VH, CL, CH… disulphide bridges, antigen binding site…]

• Após interação com Ag específico (BCR-Ag), ocorre diferenciação:
- Plasmócitos (células terminalmente diferenciadas)– Ab é secretado,
1-2 semanas “de vida”

-Células B de memória– expressam o mesmo BCR que o LB parental, maior semi-vida que plasmócitos

• Única população não-mieloide capaz de funcionar como APC!
• LB melhoram a capacidade de ligação ao Ag (aumentam a afinidade do Ab para o Ag) através do processo hipermutação somática.
• LB também são capazes de produzir Ab com diferentes funções através do processo mudança de classe/isotipo.

Question 23

Subtipos de Linfócitos B

Answer 23

• LB foliculares: subset LB mais abundante; Ab alta afinidade e células memória. Expressam MHC II, CD19, CD23 e recetores Fc.
• LB da zona marginal: Mais abundantes no baço; expressam IgM e CD27.
• Linfócitos B1: Residem nas mucosas e cavidade peritoneal.

Question 24

Tabela subtipos de linfócitos B (ver)

Answer 24

—-LB foliculares:

Ag Receptor and Specificity: Surface Ig, Diverse specificities
for many types of molecules

Selected phenotype markers: Fc receptors, MHC II, CD19, CD23

Percentage of total lymphocytes: blood 5-20%, lymph node 20-25%, spleen 40-45%

—-LB da zona marginal:

Ag Receptor and Specificity: Surface Ig, Limited specificities
for a restricted set of molecules

Selected phenotype markers: IgM, CD27

Percentage of total lymphocytes: blood 2-3%, lymph node 3-5%, spleen 7-10%

—-Linfócitos B1:

Ag Receptor and Specificity: Surface Ig, Limited specificities
for a restricted set of molecules

Selected phenotype markers: IgM, CD43, CD20, CD27 but CD70 negative

Percentage of total lymphocytes: blood 1-3%, lymph node rare, spleen rare

Question 25

Linfócitos T

Answer 25

—Local de desenvolvimento/ maturação: Timo Expressam TCR na membrana — Só reconhecem Ag apresentados no contexto de moléculas de MHC/HLA Interação do TCR com Ag específico conduz à diferenciação: - LT efetores - Células T de memória ``` —Principais subpopulações de LT: - Linfócitos T auxiliares (CD4+) - Linfócitos T citotóxicos (CD8+) - Células T reguladoras (mas também NKT, gamadelta e Células T invariantes associadas à mucosa, MAIT) ```

Question 26

Linfócitos T auxiliares

Answer 26

* Expressam a glicoproteína CD4 * Reconhecem Ag apresentado em moléculas MHC classe II * “Ajudam ” na ativação de LB, LT citotóxicos e macrófagos

Question 27

Linfócitos T citotóxicos

Answer 27

* Expressam a glicoproteína CD8 * Reconhecem Ag apresentado em moléculas MHC classe I * Eliminam células infetadas ou células tumorais

Question 28

Células T reguladoras

Answer 28

• Expressam as glicoproteínas CD4 e CD25 • Fator de transcrição Foxp3 fundamental para o seu desenvolvimento, função e sobrevivência • Ajudam a suprimir o sistema imunitário após a infeção estar resolvida i.e. controlam a extensão da resposta imunológica e impedem imunopatologia associada à resposta imunológica • Cruciais na manutenção da tolerância ao próprio

Question 29

Lymphocyte classes table (ver!!)

Answer 29

---CD4+ helper T lymphocytes Functions B cell activation (humeral immunity), Macrophage activation (cell-mediated immunity), Stimulation of inflammation Ag Receptor and Specificity alfa-beta heterodimers, diverse specificities for MHC II complexes Selected Phenotype Markers CD3+, CD4+, CD8- Percentage of Total Lymphocytes blood 35-60% lymph node 50-60% spleen 50-60% --CD8+ cytotoxic T lymphocytes Functions Killing of cells infected with intracellular microbes, tumor cells Ag Receptor and Specificity alfa-beta heterodimers, diverse specificities for MHC I complexes Selected Phenotype Markers CD3+, CD4-, CD8+ Percentage of Total Lymphocytes blood 15-40% lymph node 15-20% spleen 10-15% --Regulatory T cells Functions Suppress function of other T cells (regulation of immune responses, maintenance of self-tolerance) Ag Receptor and Specificity alfa-beta heterodimers, specific for self and some foreign antigens (MHC II) Selected Phenotype Markers CD3+, CD4+, CD25+, FoxP3+ (most common, but other phenotypes as well) Percentage of Total Lymphocytes blood rare lymph node 10% spleen 10% --Natural killer T cells Functions Supress or activate innate and adaptive immune responses Ag Receptor and Specificity alfabeta heterodimers; Limited specificity for glycolipid-CD1 complexes Selected Phenotype Markers CD56, CD16 (Fc receptor for IgG), CD3 Percentage of Total Lymphocytes blood 5-30% lymph rare spleen 10% --Mucosa-associated invariant T (MAIT) cells Functions Helper and cytotoxic functions in the gut Ag Receptor and Specificity alfa beta heterodimers; limited specificity for bacterial metabolites Selected Phenotype Markers CD3+, CD8+ (majority) Percentage of Total Lymphocytes blood 5% lymph rare spleen rare --gamma delta T lymphocytes Functions Helper and cytotoxic functions (innate immunity) Ag Receptor and Specificity gamma delta heterodimers; limited specificity for peptide and non peptide antigens Selected Phenotype Markers CD3+, CD4 and CD8 variable Percentage of Total Lymphocytes blood rare lymph rare spleen rare

Question 30

Células linfoides inatas (Innate lymphoid cells, ILCs)

Answer 30

* Têm origem no CLP (common lymphoid progenitor), mas não expressam recetores Ag específicos (BCR ou TCR) * Subdivididas atualmente em 3 grupos (ILC1, ILC2 e ILC3) distinguidos pelas citocinas que secretam, em analogia com células T auxiliares • Poderão providenciar a primeira linha de defesa a microrganismos na pele e mucosas ver tabela! Group 1 ILCS: NK cell + ILC1; t-cell subset: CTL + Th1; signature cytokines secreted by both: IFN-gamma, perforin, granzyme + IFN-gamma, TNF; Master transcriptional regulators of both: T-bet Group 2 ILCS: ILC2; t-cell subset: Th2; signature cytokines secreted by both: IL-4, IL-5, IL-13, amphiregulin; Master transcriptional regulators of both: GATA-3 Group 3 ILCS: LTi cell + ILC3; t-cell subset: Th17, Th22; signature cytokines secreted by both: IL-17A, IL-22, LTalfa, LTbeta + IL-22, IFN-gamma; Master transcriptional regulators of both: RORyt

Question 31

Células NK (Natural Killer):

Answer 31

. Resposta imunológica inata . Granulares . Reconhecem e eliminam tumores ou células infetadas com vírus

Question 32

Conceitos chave hematopoiese e células do SI

Answer 32

* CEH podem diferenciar-se em CMPs (Progenitor mieloide comum) que dão origem a todos as populações mieloides e CLPs (Progenitor linfoide comum) que originam todas as populações linfoides. À medida que os progenitores se diferenciam, estes perdem progressivamente a capacidade de auto-renovação, bem como a capacidade de dar origem a outras linhagens celulares. * As populações celulares que desempenham a maioria das funções da imunidade inata e adquirida são os fagócitos (primariamente macrófagos e neutrófilos), mastócitos, basófilos, eosinófilos, DCs e linfócitos. * Diferentes tipos e subtipos de células do sistema imunológico expressam moléculas de superfície diferentes, sendo estas denominadas de acordo com uma nomenclatura específica. Por exemplo, os Linfócitos T expressam CD4 ou CD8 à superfície. CD advém de “Cluster of Differentiation”. * Granulócitos, que incluem neutrófilos, eosinófilos, basófilos e mastócitos respondem a agentes patogénicos extracelulares, incluindo bactérias e helmintas. Quando ativados, os granulócitos libertam o conteúdo dos seus grânulos que inibem a atividade dos microrganismos. Esta população do sistema imunológico inato também produz citocinas que infuenciam a imunidade adquirida e contribuem para o desenvolvimento de respostas alérgicas. * Os neutrófilos, a população de leucócitos mais abundantes no sangue, possuem núcleo multiglobulado e grânulos citoplasmáticos, e são rapidamente recrutados para os locais de infeção e dano tecidular, onde desempenham funções fagocíticas. * Os macrófagos incluem tanto células sentinela residentes nos tecidos como células derivadas de monócitos circulantes recrutados em resposta à infeção. Todos os macrófagos são células fagocíticas que ingerem e matam microrganismos assim como células mortas, e secretam citocinas e quimiocinas que promovem recrutamento de leucócitos do sangue e iniciam a reparação de tecidos danificados. * Células dendríticas estão presentes na maioria dos tecidos e funcionam como células sentinela inatas e como células apresentadoras de antigénio (APCs) capazes de ativar células T naive. * Linfócitos T e B expressam recetores de Ag altamente diversos e específicos e são a população responsável pela especificidade e capacidade de memória das respostas imunológicas adquiridas. * Células linfoides inatas (ILCs) são células do sistema imunológico inato produtoras de citocinas que possuem uma morfologia semelhante a linfócitos. Estas desempenham funções semelhantes a linfócitos T CD4+ e CD8+. As ILCs, que incluem as células NK, não expressam recetores de antigénio diversos. * Linfócitos T e B derivam de um precursor comum residente na medula óssea. O desenvolvimento dos linfócitos B ocorre na medula óssea, ao passo que os precursores de linfócitos T migram da medula e maturam no timo. Após maturação/diferenciação, os linfócitos B e T deixam a medula e o timo, entram na circulação e colonizam orgãos linfoides secundários/periféricos. * Linfócitos T e B naive são células maduras (que terminaram o processo de maturação/diferenciação) mas que ainda não foram estimuladas pelo Ag. Ao encontrar o Ag, estas células proliferam e diferenciam-se em linfócitos efetores que possuem um papel na resposta imunológica protetora contra patogénios. Linfócitos B efetores são células produtoras de anticorpos (plasmócitos). Células T efetoras incluem linfócitos T CD4+ produtores de citocinas e linfócitos T CD8+ citotóxicos. * Parte da progenitura de linfócitos B e T ativados dá origem a células de memória que sobrevivem por longos periodos de tempo num estadio quiescente. Estas são responsáveis pela resposta rápida e aumentada aquando da exposição subsequente ao mesmo Ag.