Presentaties Flashcards
ORI
De multiplicatie van plasmiden begint altijd bij de origin of replication (ORI). Hier start de DNA replicatie.
ampicilline resistentie gen
Het ampicilline resistentie gen codeert voor de beta-lactamase, dit is een enzym. Het breekt de lactam ring in ampicilline en zorgt daarmee voor de inactivatie van ampicilline. Wanneer een bacterie een ampicilline resistentie gen bevat is deze resistent tegen de antibiotica soort ampicilline.
Een multiple cloning site
Een multiple cloning site is een heel klein stukje plasmide dat unieke restrictie sites bevat (1 knipplek per plasmide) die herkend worden door restrictie enzymen.
Promotor
Deze regelt de mate van transcriptie binnen een plasmide. Sommige promotors kunnen aan of uit gezet worden.
Kloneren uitleggen
Eerst wordt een plasmide opengeknipt met behulp van restrictie enzymen. In dit weggeknipte stuk wordt een stuk geïsoleerd DNA geplaatst. Dit wordt getransformeerd door het in cellen te brengen. De plasmide wordt in cellen gebracht door het op een plaat aan te brengen.
Deze getransformeerde cellen kunnen vervolgens van de plaat afgehaald en kunnen uit de bacteriën worden gehaald.
Dit gewenste DNA kan vervolgens ook nog worden vermeerderd en kan hierna worden geanalyseerd.
Noem de 4 normale deoxyribonuleotiden
dATP, dCTP, dGTP en dTTP
noem de verschillende plasmiden
Plasmide
cosmide
YAC
BAC
Cosmide
een plasmide die cossequenties bevat. Wanneer deze in een bacterie zit, dus gewoonlijk, is deze een circulair molecuul. Echter is de cosmide wanneer deze zich in een bacteriofaag bevindt een lineair molecuul.
YACs
YACs worden gebruikt om databanken te maken van eukaryoot DNA. De chromosomen worden vermeerderd in gist.
BACs
BACs worden gebruikt voor het kloneren van vreemd DNA in bacteriën.
Transformeren
inbrengen van een stukje DNA om het te vermeerderen
chemische transformatie
Bij chemische transformatie moeten eerst te cellen competent worden gemaakt om het DNA op te kunnen nemen. Dit gebeurd door kleine gaatjes te maken in de celmembraan, hierdoor kan het DNA in de cel treden. Deze procedure is nog best lastig om uit te voeren aangezien bacteriën die gaten in hun membraan hebben niet stabiel zijn waardoor ze snel dood gaan. Deze zijn dan niet meer bruikbaar.
electroporatie
Bij electroporatie wordt een korte spanningspuls op de cel gezet waardoor (bij de juiste spanning) kleine poriën in het celmembraan ontstaan. Bij hoge plasmide concentraties worden deze dan opgenomen door de cel.
gene gun
Bij gene gun wordt het DNA gecoat aan goeden of wolfraam bolletjes. Deze kleine bolletjes worden dan de cel ingeschoten. DNA in de cel kan worden gerepliceerd en getranscribeerd.
Bacteriofagen transformatie
De bacteriofaag bindt aan de cel en dropt het DNA in de cel. Vervolgens kan het de lytische cyclus in gaan of de lysogene cyclus.
lysogenic weg
Bij de lysogenic weg wordt DNA in genomisch DNA ingebouwd. Deze replicatie gaat gepaard met de celdeling.
lytic weg
Bij de lytic weg worden grote hoeveelheden bacteriofagen geproduceerd, deze worden uiteindelijk losgelaten en losgelaten.
Bij Agrobacterium tumefaciens
Bij Agrobacterium tumefaciens kunnen agrobacteriën recombinant DNA in
een gastheer brengen. Agrobacteriën infecteren planten, ze induceren de celdeling van plantencellen.
Een operator
Een operator is een regulatoire DNA sequentie die de expressie van het operon reguleert. Aan deze operator binden verschillende eiwitten, of een repressor (zet genen uit) of een activator (zet genen aan)
Regulatie trypofaan operon
als de tryptofaan concentraties laag zijn wil je dat er eiwitten komen die tryptofaan maken. Als de concentratie laag is, is de repressor inactief en kan RNA polymerase binden en wordt mRNA gemaakt, de genen staan dus aan. Als de concentratie hoog is, kan de tryptofaan in het eiwit aan de repressor binden waardoor hij actief wordt en hij bind aan de operator, hierdoor kan RNA polymerase niet binden en geen mRNA gemaakt worden, het gen staat uit. Dus geen tryptofaan aanwezig moet de bacterie eigen maken en staan de genen aan. Als er wel tryptofaan is bind de repressor aan de operator waardoor geen mRNA gemaakt kan worden en het gen uit staat.
Regulatie LAC operon
codeert voor genen voor de import en afbraak van lactose. Als er glucose en lactose in het medium zit hoeven er geen genen aan die lactose afbreken tot glucose. Wanneer er geen lactose is bind de repressor en staat het gen uit. Wanneer er geen glucose en geen lactose is bind de repressor en de CAP bind. Zodra er alleen lactose aanwezig is en geen glucose aanwezig is moeten de genen die lactose omzetten in glucose wel aan. De cap blijft gebonden en de repressor bind niet waardoor RNA polymerase kan binden en mRNA gemaakt kan worden, de genen staan aan.
Forume lineair verband tussen de hoeveelheid start materiaal en het aantal PCR rondes die je moet draaien om een X niveau aan DNA hoeveelheid te maken.
Hoeveelheid DNA = N * 2^cyclus nummer
Leg het doel van Reverse transcriptase uit
Het mRNA wordt uit een eukaryote cel geïsoleerd. Hier wordt Reverse Transcriptase aan toegevoegd. Dit breekt het mRNA af met RNaseH, het cDNA kan vervolgens worden vermenigvuldigd met behulp van PCR. Het cDNA kan worden gekloneerd in een plasmide.
Mutagenesis
Mutagenesis is het proces waarbij genen van een organisme gericht veranderd
worden, dus een mutatie. Bij eiwitonderzoek leidt dit tot een verandering in de aminozuren. Deze methode wordt gebruikt om onderzoek te doen naar de functies van eiwitten en het verbeteren hiervan.
Site directed mutagenese
je hebt een primer met daarin de mutatie, deze bind aan de plasmide en wordt van 5 naar 3 verlengt, deze worden enkelstreng gekopieerd en in een cel getransformeerd, je hebt dan de wild type en de mutant, in de mutant zit te gewenste mutatie die zorgt voor aminozuur verandering. Deze techniek is wat moeilijker omdat je moeilijk de mutatant en de wildtype kunt onderscheiden.
cassette mutagenese
je hebt een plasmide die je knipt met restrictie enzymen. Vervolgens koop je een primer met de mutatie erin. De primers hebben de zelfde overhang als de geknipte plasmide, hierdoor kun je ze ligeren en bevat de plasmide nu de mutatie
PCR gebaseerd mutagenese
je hebt DNA dat je pcr’t met 2 primers, in 1 primer zit de mutatie, op de punt is de mutatie. Vervolgens doe je nog een pcr reactie met weer 1 normale primer en 1 primer met mutatie. Van beide reacties krijg je DNA met een mutatie aan het uiteinde. Deze mix je en verhit je, vervolgens laat je ze hybrydiseren waardoor 1 streng van elke reactie met elkaar gaan binden, de 1 kan niet ‘bestaan’ want die kan niet verlengt worden en de andere wel, die wordt verlengt en vervolgens heb je een dubbelstrengs DNA met de mutatie erin.
Quickchange mutagenese
je hebt een plasmide en een e coli die dam methylase bevat. Je maakt 2 overlappende primers met een mutatie erin, en pcr je alles. Je krijgt dan 2 plasmides. Vervolgens knip je het plasmide met DpnI, deze is alleen gevoelig voor het orginele plasmide DNA (aangezien deze dam bevat). En blijft alleen de plasmide over met de mutatie erin.
Micro RNA (miRNA)
Wanneer er sprake is van een hoge genexpressie kan er mRNA worden weggevangen zodat er minder getransleerd wordt.
Dit wordt door de cel zelf gemaakt, gebeurd in de kern. Het wordt gecodeerd in het DNA.
Short interference RNA (siRNA)
Wanneer er sprake is van een hoge genexpressie kan er mRNA worden weggevangen zodat er minder getransleerd wordt. dsRNA is in planten ontdekt. Het komt de cel binnen met behulp van een virus of een expressie plasmide. Ook kan dit natuurlijk door analisten worden gedaan. Hiervoor moet gewoon een lange primer worden besteld.
De RNA interference (RNAi)
RNA interference is het wegvangen van RNA.
Het RNA interference (RNAi) mechanisme
siRNA wordt in kleinere stukken geknipt door het Dicer enzym. De strengen vallen uiteen, 1 van deze strengen wordt afgebroken. Een eiwitcomplex bindt aan het RNA. Het RNA-RISC complex bindt complementair aan zijn target RNA. Het target RNA wordt afgebroken
Leg uit, DNA wordt verpakt
Het DNA wordt als eerst gewonden om een complex van 8 histonen. Dit wordt een nucleosoom genoemd. Deze nucleosomen worden door Histone H1 verpakt in fiber. Hierna worden loops gevormd. Vervolgens wordt het verder opgevouwen en ontstaat het interfase chromosoom en als laatste wanneer het nog hechter is opgevouwen ontstaat het mitotische chromosoom.
Chromatine
het complex van DNA en eiwitten in de celkern van eukaryotische cellen. Het chromatine bestaat uit een reeks nucleosomen.
Euchromatine
Dit zijn chromosoom delen waar genen zitten die hoog tot expressie komen → het zijn losse verpakkingen van chromatine → er is veel ruimte voor eiwitten om te binden
Heterochromatine
Dit zijn chromosoom delen waar genen zitten die laag tot expressie komen → hebben een compacte verpakking van chromatine → er is weinig ruimte voor eiwitten om te binden
Methylatie
Methylatie is een vorm van epigenetica. Wanneer een methylgroep wordt gebonden aan DNA wordt meestal expressie van het gen omlaag gebracht. Dit is meestal onomkeerbaar.
Helicase: functie DNA replicatie
verbreekt waterstofbruggen
Overeenkomsten tussen transcriptie en replicatie
Ze openen beide het DNA molecuul
Eén streng DNA werkt als template voor de synthese
Nucleotides worden één voor één toegevoegd en covalent gebonden
Verschillen tussen transcriptie en replicatie
RNA streng blijft niet gebonden aan het DNA molecuul
Het RNA is korter, enkelstrengs en kan meerdere vormen aannemen Transcriptie wordt uitgevoerd door RNA polymerase, dit werkt zonder primer
Single stranded DNA binding eiwit: functie DNA replicatie
houdt het DNA enkelstrengs
Primase; functie DNA replicatie
(RNA polymerase) de RNA primer is een stukje RNA dat geproduceerd wordt door primase en het dient als begin voor de DNA synthese
DNA polymerase III: functie DNA replicatie
bouwt het DNA
Clamp loader & sliding clamp: functie DNA replicatie
houdt het DNA polymerase gebonden aan de DNA streng en loader plaatst de clamp door hydrolyse van ATP.
RNAse H: functie DNA replicatie
verwijdert de RNA primer
DNA polymerase I: functie DNA replicatie
vult het gat waar de pimer zat
DNA ligase: functie DNA replicatie
zorgt voor de verbinding tussen de 2 strengen
Operon
zijn alleen te vinden in bacteriën, dit zijn meerdere genen die door 1 promotor gereguleerd worden. De eiwitten die voor deze genen coderen werken samen aan 1 proces.
