Leerdoelen pag. 4 Flashcards
Transformatie
Nadat het gewenste plasmide is gemaakt kan deze worden ingebracht in een bacteriële cel waardoor deze vermeerderd wordt. De bacteriële cellen vermenigvuldigen namelijk snel, zo krijg je veel kopieën van je gewenste plasmide. Dit inbrengen van een stukje DNA om het te vermeerderen wordt transformeren genoemd.
5 technieken van transformatie
Chemische transformatie Electroporatie Gene gun Bacteriofaag Agrobacterium tumefaciens
chemische transformatie
transformatie
Bij chemische transformatie moeten eerst te cellen competent worden gemaakt om het DNA op te kunnen nemen. Dit gebeurd door kleine gaatjes te maken in de celmembraan, hierdoor kan het DNA in de cel treden. Deze procedure is nog best lastig om uit te voeren aangezien bacteriën die gaten in hun membraan hebben niet stabiel zijn waardoor ze snel dood gaan. Deze zijn dan niet meer bruikbaar.
electroporatie
transformatie
Bij electroporatie wordt een korte spanningspuls op de cel gezet waardoor (bij de juiste spanning) kleine poriën in het celmembraan ontstaan. Bij hoge plasmide concentraties worden deze dan opgenomen door de cel.
gene gun
transformatie
Bij gene gun wordt het DNA gecoat aan goeden of wolfraam bolletjes. Deze kleine bolletjes worden dan de cel ingeschoten. DNA in de cel kan worden gerepliceerd en getranscribeerd.
lygenic weg of de lytic weg. (bacteriofaag)
transformatie
Bij de lysogenic weg wordt DNA in genomisch DNA ingebouwd. Deze replicatie gaat gepaard met de celdeling.
Bij de lytic weg worden grote hoeveelheden bacteriofagen geproduceerd, deze worden uiteindelijk losgelaten en losgelaten.
Agrobacterium tumefaciens
transformatie
Bij Agrobacterium tumefaciens kunnen agrobacteriën recombinant DNA in een gastheer brengen. Agrobacteriën infecteren planten, ze induceren de celdeling van plantencellen.
Een cloning vector
Vector die wordt gebruikt voor het kloneren van het DNA/RNA wat het bevat
Een expression vector
is een plasmide of viraal DNA dat is bedoeld voor het uitvoeren van de genexpressie in cellen. De vector wordt gebruikt voor het introduceren van specifieke genen in een target cel, deze kan dan de mechanismen in de cel besturen en zo zorgen voor de eiwit synthese om eiwitten te produceren die coderen voor het gewenste gen (dus het ingebrachte gen).
Een plasmide
is cirkelvormig DNA die zich buiten het chromosomaal DNA bevindt van sommige eencellige organismen zoals bacteriën. Deze kunnen tussen soorten worden uitgewisseld.
Een cosmide
is een type plasmide dat een lambda faag (cos) sequentie bevat. Deze worden vaak gebruikt als cloning vector.
M13
is een bacteriofaag dat bestaat uit circulair enkelstrengs DNA. Deze infecteert E. coli waar het kan vermeerderen.
YACs
worden gebruikt om databanken te maken van eukaryoot DNA. Deze chromosomen worden gemaakt uit het DNA van gist. Deze kunnen worden gebruikt om eukaryote eiwitten die posttranslationale modificatie nodig hebben, tot expressie brengen.
BACs
worden gebruikt voor het kloneren van vreemd DNA in bacteriën, voornamelijk in de bacterie E. coli. De bacteriofaag lambda is een bacterieel virus die de bacterie soort E. coli infecteert.
Een selectable marker
is een gen die is geïntroduceerd aan een cel, vooral in een bacterie of in een celcultuur die het mogelijk maken om een selectie uit te voeren.
Ampicilline marker functie
Remt de synthese van de celwand bij Gram-negatieve bacteriën.
Tetracycline marker functie
Bindt aan ribosomale 30S subunit en blokkeert hierdoor de translocatie van ribosoom langs mRNA; het remt de eiwitsynthese
Chloramphenicol marker functie
Bindt aan ribosomale 50S unit en remt de
eiwitsynthese
Kanamycine/neomycine marker functie
Bindt aan ribosomale componenten en remt de eiwitsynthese
Bleomycine marker functie
Bindt aan DNA en remt DNA- RNA synthese
Hygromycine B marker functie
Remt de translocatie van ribosoom langs mRNA; remt eiwitsynthese
reverse transcriptase PCR
Bij reverse transcriptase PCR moet er cDNA worden gemaakt door het reverse transcripteren van de RNA templates met behulp van het enzym reverse transcriptase. Deze techniek wordt gebruikt voor het kwantitatief bestuderen van de gen expressie. Ook kan het worden gecombineerd met Real Time PCR om de RNA niveaus te kunnen bestuderen.
Real Time PCR
Een Real Time PCR is een techniek waarmee gen expressie gemeten kan worden. De Real Time PCR moet worden uitgevoerd met cDNA, daarom is het belangrijk om dit cDNA te maken vanuit het mRNA. Vervolgens wordt de PCR reactie uitgevoerd. Hierbij wordt gebruik gemaakt van fluorescent gelabelde deeltjes. Er wordt dus een PCR uitgevoerd waarbij het DNA wordt geamplificeerd.
Een Genomische bibliotheek
Is een verzameling van het totale genomische DNA van één enkel organisme. Het DNA is onderverdeeld en opgeslagen in verschillende populaties van op elkaar lijkende vectoren.
Een cDNA bibliotheek
is een combinatie van gekloneerde cDNA fragmenten die zijn ingebracht in een collectie van host cellen. Al het opgeslagen genetische materiaal dat is verkregen door de omzetting van mRNA van een specifiek monster naar DNA fragmenten die gekloneerd kunnen worden in een geschikte vector.
Bij reverse transcriptase
wordt mRNA omgezet naar cDNA.
RNase H
zorgt ervoor dat het mRNA wordt afgebroken van de complementaire streng zodat het cDNA kan worden gevormd.
Een mutatie
is een verandering in het erfelijke materiaal van een organisme waardoor er één of meer eigenschappen veranderen. Het kan spontaan gebeuren of optreden door factoren van buitenaf, door bijvoorbeeld chemische stoffen (te veel octanol opsnuiven op het lab) of straling.
Een silent mutatie
is een mutatie waarbij het nieuwe codon codeert voor hetzelfde aminozuur, dit heeft dus geen gevolgen voor het fenotype.
Een missense mutatie
een mutatie waarbij het nieuwe codon codeert voor een ander aminozuur.
Een nonsense mutatie
is een mutatie waarbij het nieuwe codon codeert voor een stopcodon, het eiwit wordt dan dus ingekort.
Een frame shift mutatie
is een mutatie waarbij er 1 nucleotide wordt weggehaald of bijgevoegd. Hierdoor wordt de hele eiwitvolgorde veranderd en ontstaan er compleet andere aminozuren.
Bacteriofagen
Bacteriofagen kunnen recombinant DNA in een gastheercel brengen. Dit kan gebeuren volgens de lygenic weg of de lytic weg.
Mutagenisis
je wilt een mutatie maken in hen gen dat codeerd voor een eiwit, dit doe je om te kijken naar de functies van eiwitten en soms te verbeteren. Hier zijn verschillende technieken voor.
