PR- Méthodes d'étude Flashcards
les étapes d’une culture primaire
-dissociation
-mise en culture
+/- prolifération
dans une culture primaire où sont déposées les cellules
dans un milieu favorable à leur survie
quel est l’intérêt de la mise en culture
le contrôle des conditions d’étude
comment obtient on des cultures secondaires?
par la réalisation d’un repiquage
déf et caractéristiques d’une lignée cellulaire
cellules immortelles qui se caractérisent par:
-une absence d’apoptose et de sénescence
-un cycle cellulaire très court
-des mitoses facilitées
moyens d’obtenir une lignée cellulaire?
-cellules rendues cancéreuses
-contaminées par un virus (virus de l’herpès par ex)
-modifiées par génie génétique
le - d’une lignée cellulaire
dérivation de souche
def anticorps
Ac = immunoglobuline: c’est une glycoprotéine synthétisée par des plasmocytes, capable grâce à son paratope de reconnaître et de se fixer à l’épitope d’un antigène spécifique, afin de former un complexe immun Ag-Ac.
les +/- des Ac monoclonaux et polyclonaux
-Ac monocolnaux
+: spécificité (qualitatif) = on est sûrs d’avoir reconnu le bon Ag
-: risque de perdre en sensibilité
-Ac polyclonaux
+ : sensibilité (quantitatif) = on est sûrs que les Ag vont se fixer
- : risque de se lier au mauvais Ag
qu’est ce que l’affinité?
force de liaison Ag/Ac
diff entre Ac monoclonaux et polyclonaux
-monoclonaux; mélange d’un seul type d’Ac reconnaissant un seul type d’épitope
-polyclonaux: mélange d’Ac reconnaissant de multiples épitopes d’un même Ag –> Ac monospécifique; de plusieurs Ag –> Ac polyspécifiques
avantage du marquage indirect
-fluorescence doublée
-simplification des manipulations expérimentales lorsqu’on analyse plusieurs protéines en même temps car il est alors possible d’utiliser les différents anticorps dirigés chacun vers leur protéine respective, et de les révéler avec un même anticorps secondaire fluorescent.
rôle de l’immunomarquage
déterminer la localisation d’une protéine dans une coupe de tissus
Comment empêche t on que le tissu soit altéré dans l’immunomarquage
on utilise des fixateurs ex: formol, PFA
immunohistochimie = ?
Ac de révélation couplé à une enzyme qui convertit un substrat incolore en 1 substrat coloré qui se dépose au niveau de la membrane de l’Ac
–> observée au MO
immunohistofluorescence
colorant fluorescent fixé à l’Ac de révélation
–> microscope UV à fluorescence
rôle et étapes d’un WB?
permet de détecter de façon semi-quantitative l’expression d’une protéine par
1) électrophorèse
2) transfert (= blot)
3) révélation/détection
électrophorèse = ?
+ spécificités dans WB
ensemble des méthodes qui séparent les molécules en fct de leur masse, volume et charge en les plaçant dans un gel de polymères soumis à un champ électrique
gel de polyacrylamide en présence de SDS (détergent anionique) qui
-permet solubilisation: protéines linéarisées car éliminations des liaisons faibles (=p° dénaturées)
-charge protéines négativement (=> FORCÉMENT migration vers l’anode)
le blot ?
- transfert sur une mb de nitrocellulose
les protéines se fixent grâce à des interactions hydrophobes
-blocage des sites libres de la mb pour limiter les interactions non spécifiques avec l’Ac (utilisé dans le 3e étape)
dans un blot comment bloque t on les sites libres de la mb de nitroceullose
en utilisant du lait en poudre solubilisé dans les tampons d’incubation des Ac
dans un WB méthodes pour la révélation/détection?
1) Immunomarquage + Lavage
2) bleu de Coomasie (révèle toutes les protéines = non spécifique)
3) Ac secondaire de révélation conjugué avec radiotraceur
puis on soumet la mb à une autoradiographie
rôle de l’IP
isoler, à l’aide d’un Ac, une molécule au sein d’un mélange
étapes d’une IP
- Extraction des protéines de la cellule que l’on retrouvera sous forme de lysat après une centrifugation.
- Ajout d’un anticorps anti A dans le mélange. Formation d’un complexe “Ac anti-A /protéine A”.
- Ajout de molécules qui rendent le complexe « Ac / Ag » insoluble, on dit qu’on “leste” notre anticorps.
- Centrifugation : cela aide le complexe à tomber dans le culot.
- Extraction du culot avec le complexe “Ac – protéine A” précipité
rôle de la co-IP
mise en évidence de l’interaction entre 2 protéines d’intérêt
étapes d’une co-IP
- On met la protéine A dans un tube à essai en condition NON dénaturante pour préserver les interactions (contact entre deux molécules) car celles-ci sont en grande partie dues à des liaisons faibles.
− Si A et B interagissent, ils vont former un complexe (ils seront liés) − Si A et B n’interagissent pas, ils vont faire leur vie chacun de leur côté. - Ajout d’un anticorps anti-A dans le mélange
− Si A et B interagissent, il y a formation d’un complexe « Ac anti-A – protéine A - protéine B » : tube à essai 3.
− Si A et B n’interagissent pas, il y a formation d’un complexe « Ac anti-A – protéine A » - On centrifuge pour faire tomber le complexe dans le culot.
- On récupère le culot
− Soit il contient le complexe « Ac anti A / protéine A / protéine B » dans le précipité (= culot). On dit que la protéine B est co-immunoprécipité
− Soit il ne contient que le complexe « Ac anti A / protéine A ». La protéine B n’a pas précipité. - WB de la protéine B en condition dénaturante (à l’aide d’anticorps anti-B). Si A et B interagissent, le Western Blot (avec Ac anti-B) révèle la présence de la protéine B.
étapes de la si-ARN
- On fait rentrer le siARN dans les cellules via des liposomes (vésicule artificielle formée par des bicouches lipidiques concentriques), par exemple.
- Le siARN se lit au complexe RISC qui le prend en charge, et le sépare en deux brins.
- Ce dernier retrouve un ARNm complémentaire au brin du siARN.
- Il s’associe avec l’ARNm et le clive.
- Cela entraîne la dégradation de l’ARNm.
centrifugation : but, moyens (principes physiques utilisés), résultats. Quels sont les 2 types?
-séparer les différents constituants cellulaires par rotation à grande vitesse
-accélération de l’effet de la gravité qui entraîne sédimentation
-on obtient 2 compartiments dans le tube: le culot (au fond, plus dense) et le surnageant
-centrifugation différentielle et centrifugation par gradient de densité
unité du coeff de sédimentation
svedberg (S)
étapes de la centrifugation différentielle
suspension de cellules lysées –>
-centri 1 (800g pendant 10 min) –> noyaux
-centri 2 (1 500g pendant 10 min) –> mitochondries et lysosomes
-centri 3 (100 000g pendant 1h) –> fragments de mb plasmique et de microsomes
-centri 4 –> 200 000g pendant 3h –> ribosomes
centrifugation en gradient de densité
dans un tube de saccharose avec une concentration croissante du haut vers le fond du tube
but de la cytométrie en flux
trier et séparer des cellules selon l’intensité de la fluorescence émise, ce qui leur permet d’être classées selon des critères comme la taille ou la granulosité.
suppression du gène dans tout l’organisme ( manipulations génétiques)
KO total
suppression du gène dans un seul tissu ( manipulations génétiques)
KO spécifique
surexpression du gène ( manipulations génétiques)
KI
système cre/lox
utilisation de l’enzyme cre-recombinase pour couper un fragment d’ADN situé entre 2 séquences appelées lox
Protocole de crispr/cas9
-un fragment d’ARN (appelé crispr) reconnaît une séquence spécifique sur l’ADN
-une nucléase (cas 9) se fixe sur la séquence spécifique d’ADN et se coupe les 2 brins d’ADN à cet endroit précis
-on peut introduire un brin d’ADN présentant la séquence qu’ils désirent introduire (appelée matrice) : elle servira de modèle au moment de la réparation de l’ADN clivé. (marche que dans 40 % des cas)
