PR- Méthodes d'étude

Question 1

les étapes d’une culture primaire

Answer 1

-dissociation
-mise en culture
+/- prolifération

Question 2

dans une culture primaire où sont déposées les cellules

Answer 2

dans un milieu favorable à leur survie

Question 3

quel est l’intérêt de la mise en culture

Answer 3

le contrôle des conditions d’étude

Question 4

comment obtient on des cultures secondaires?

Answer 4

par la réalisation d’un repiquage

Question 5

déf et caractéristiques d’une lignée cellulaire

Answer 5

cellules immortelles qui se caractérisent par:
-une absence d’apoptose et de sénescence
-un cycle cellulaire très court
-des mitoses facilitées

Question 6

moyens d’obtenir une lignée cellulaire?

Answer 6

-cellules rendues cancéreuses
-contaminées par un virus (virus de l’herpès par ex)
-modifiées par génie génétique

Question 7

le - d’une lignée cellulaire

Answer 7

dérivation de souche

Question 8

def anticorps

Answer 8

Ac = immunoglobuline: c’est une glycoprotéine synthétisée par des plasmocytes, capable grâce à son paratope de reconnaître et de se fixer à l’épitope d’un antigène spécifique, afin de former un complexe immun Ag-Ac.

Question 9

les +/- des Ac monoclonaux et polyclonaux

Answer 9

-Ac monocolnaux
+: spécificité (qualitatif) = on est sûrs d’avoir reconnu le bon Ag
-: risque de perdre en sensibilité
-Ac polyclonaux
+ : sensibilité (quantitatif) = on est sûrs que les Ag vont se fixer
- : risque de se lier au mauvais Ag

Question 10

qu’est ce que l’affinité?

Answer 10

force de liaison Ag/Ac

Question 11

diff entre Ac monoclonaux et polyclonaux

Answer 11

-monoclonaux; mélange d’un seul type d’Ac reconnaissant un seul type d’épitope
-polyclonaux: mélange d’Ac reconnaissant de multiples épitopes d’un même Ag –> Ac monospécifique; de plusieurs Ag –> Ac polyspécifiques

Question 12

avantage du marquage indirect

Answer 12

-fluorescence doublée
-simplification des manipulations expérimentales lorsqu’on analyse plusieurs protéines en même temps car il est alors possible d’utiliser les différents anticorps dirigés chacun vers leur protéine respective, et de les révéler avec un même anticorps secondaire fluorescent.

Question 13

rôle de l’immunomarquage

Answer 13

déterminer la localisation d’une protéine dans une coupe de tissus

Question 14

Comment empêche t on que le tissu soit altéré dans l’immunomarquage

Answer 14

on utilise des fixateurs ex: formol, PFA

Question 15

immunohistochimie = ?

Answer 15

Ac de révélation couplé à une enzyme qui convertit un substrat incolore en 1 substrat coloré qui se dépose au niveau de la membrane de l’Ac
–> observée au MO

Question 16

immunohistofluorescence

Answer 16

colorant fluorescent fixé à l’Ac de révélation
–> microscope UV à fluorescence

Question 17

rôle et étapes d’un WB?

Answer 17

permet de détecter de façon semi-quantitative l’expression d’une protéine par
1) électrophorèse
2) transfert (= blot)
3) révélation/détection

Question 18

électrophorèse = ?
+ spécificités dans WB

Answer 18

ensemble des méthodes qui séparent les molécules en fct de leur masse, volume et charge en les plaçant dans un gel de polymères soumis à un champ électrique

gel de polyacrylamide en présence de SDS (détergent anionique) qui
-permet solubilisation: protéines linéarisées car éliminations des liaisons faibles (=p° dénaturées)
-charge protéines négativement (=> FORCÉMENT migration vers l’anode)

Question 19

le blot ?

Answer 19

• transfert sur une mb de nitrocellulose
  les protéines se fixent grâce à des interactions hydrophobes
  -blocage des sites libres de la mb pour limiter les interactions non spécifiques avec l’Ac (utilisé dans le 3e étape)

Question 20

dans un blot comment bloque t on les sites libres de la mb de nitroceullose

Answer 20

en utilisant du lait en poudre solubilisé dans les tampons d’incubation des Ac

Question 21

dans un WB méthodes pour la révélation/détection?

Answer 21

1) Immunomarquage + Lavage
2) bleu de Coomasie (révèle toutes les protéines = non spécifique)
3) Ac secondaire de révélation conjugué avec radiotraceur
puis on soumet la mb à une autoradiographie

Question 22

rôle de l’IP

Answer 22

isoler, à l’aide d’un Ac, une molécule au sein d’un mélange

Question 23

étapes d’une IP

Answer 23

1. Extraction des protéines de la cellule que l’on retrouvera sous forme de lysat après une centrifugation.
2. Ajout d’un anticorps anti A dans le mélange. Formation d’un complexe “Ac anti-A /protéine A”.
3. Ajout de molécules qui rendent le complexe « Ac / Ag » insoluble, on dit qu’on “leste” notre anticorps.
4. Centrifugation : cela aide le complexe à tomber dans le culot.
5. Extraction du culot avec le complexe “Ac – protéine A” précipité

Question 24

rôle de la co-IP

Answer 24

mise en évidence de l’interaction entre 2 protéines d’intérêt

Question 25

étapes d’une co-IP

Answer 25

1. On met la protéine A dans un tube à essai en condition NON dénaturante pour préserver les interactions (contact entre deux molécules) car celles-ci sont en grande partie dues à des liaisons faibles.
   − Si A et B interagissent, ils vont former un complexe (ils seront liés) − Si A et B n’interagissent pas, ils vont faire leur vie chacun de leur côté.
2. Ajout d’un anticorps anti-A dans le mélange
   − Si A et B interagissent, il y a formation d’un complexe « Ac anti-A – protéine A - protéine B » : tube à essai 3.
   − Si A et B n’interagissent pas, il y a formation d’un complexe « Ac anti-A – protéine A »
3. On centrifuge pour faire tomber le complexe dans le culot.
4. On récupère le culot
   − Soit il contient le complexe « Ac anti A / protéine A / protéine B » dans le précipité (= culot). On dit que la protéine B est co-immunoprécipité
   − Soit il ne contient que le complexe « Ac anti A / protéine A ». La protéine B n’a pas précipité.
5. WB de la protéine B en condition dénaturante (à l’aide d’anticorps anti-B). Si A et B interagissent, le Western Blot (avec Ac anti-B) révèle la présence de la protéine B.

Question 26

étapes de la si-ARN

Answer 26

1. On fait rentrer le siARN dans les cellules via des liposomes (vésicule artificielle formée par des bicouches lipidiques concentriques), par exemple.
2. Le siARN se lit au complexe RISC qui le prend en charge, et le sépare en deux brins.
3. Ce dernier retrouve un ARNm complémentaire au brin du siARN.
4. Il s’associe avec l’ARNm et le clive.
5. Cela entraîne la dégradation de l’ARNm.

Question 27

centrifugation : but, moyens (principes physiques utilisés), résultats. Quels sont les 2 types?

Answer 27

-séparer les différents constituants cellulaires par rotation à grande vitesse
-accélération de l’effet de la gravité qui entraîne sédimentation
-on obtient 2 compartiments dans le tube: le culot (au fond, plus dense) et le surnageant
-centrifugation différentielle et centrifugation par gradient de densité

Question 28

unité du coeff de sédimentation

Answer 28

svedberg (S)

Question 29

étapes de la centrifugation différentielle

Answer 29

suspension de cellules lysées –>
-centri 1 (800g pendant 10 min) –> noyaux
-centri 2 (1 500g pendant 10 min) –> mitochondries et lysosomes
-centri 3 (100 000g pendant 1h) –> fragments de mb plasmique et de microsomes
-centri 4 –> 200 000g pendant 3h –> ribosomes

Question 30

centrifugation en gradient de densité

Answer 30

dans un tube de saccharose avec une concentration croissante du haut vers le fond du tube

Question 31

but de la cytométrie en flux

Answer 31

trier et séparer des cellules selon l’intensité de la fluorescence émise, ce qui leur permet d’être classées selon des critères comme la taille ou la granulosité.

Question 32

suppression du gène dans tout l’organisme ( manipulations génétiques)

Answer 32

KO total

Question 33

suppression du gène dans un seul tissu ( manipulations génétiques)

Answer 33

KO spécifique

Question 34

surexpression du gène ( manipulations génétiques)

Answer 34

KI

Question 35

système cre/lox

Answer 35

utilisation de l’enzyme cre-recombinase pour couper un fragment d’ADN situé entre 2 séquences appelées lox

Question 36

Protocole de crispr/cas9

Answer 36

-un fragment d’ARN (appelé crispr) reconnaît une séquence spécifique sur l’ADN
-une nucléase (cas 9) se fixe sur la séquence spécifique d’ADN et se coupe les 2 brins d’ADN à cet endroit précis
-on peut introduire un brin d’ADN présentant la séquence qu’ils désirent introduire (appelée matrice) : elle servira de modèle au moment de la réparation de l’ADN clivé. (marche que dans 40 % des cas)