3-méthode d'étude partie 2 Flashcards
les 3 types de manipulations sur l’expressions d’un gène
-augmenter expression = KI knock in
-diminuer expression = KD knock down
-inhiber expression = KO knock out
les 3 possibilités in vivo de l’éliination du gène
-KO total= tout l’organisme
-KO conditionnel= élimination du gène à partir d’un stade du développement donné
-KO tissu-spécifique
comment se fait l’entrée de siRNA dans la cellule puis sa prise en charge
entrée par transfection dépendante des lipides
puis prise en charge par complexe RISC
exemple application siRNA
mesure de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose dans une lignée de cellules bêta pancréatiques invalidées pour les gènes AC1 et AC8
diff siRNA in vitro et siRNA in vivo
dans in vivo : siRNA emballés dans un vesteur qui est une enveloppe virale modifiée
inconvénient de siRNA en in vivo
difficile de cibler un type de cellules
qu’est ce que cre et lox?
-cre recombinase = enzyme qui empéche transcription d’un gène située entre 2 séquences lox p
exemple d’application cre lox
-mesure de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose chez les souris invalidées totalement pour le gène AL8; obtenues par croisement souris cre x souris AC8-lox
-reproduction chez l’animal d’une pathologie humaine: mutation MC4R
-souris KO Znt8: mesure du poids et de la tendance au diabète
pour invalidation tissu-spécifique quel promoteur “cellule spécifique” pour foie/cellules beta pancréatique/muscle/neurone en amont du gène cre
-albumine pour le foie
-actine pour le muscle
-insuline
-nex
gain de fonction par cre lox
souris “stop cassette” entourée de lox p
x
souris cre
éléments et fonctions de base (dans les bactéries) du système crispr cas 9
système composé de
-gènes cas
-locus crispr: alternance de courtes séquences nucléotidiques qui sont intercalées entre des séquences variables
-séquence guide
fonctionnent:
qd il y a ADN exogène, il est dirigé vers l’extrêmité du locus crispr où il sera intégré
lors d’une infection: endonucléase du système guidée par ARNcr induit coupure double brin
pour couper un gène avec la méthode crispr comment doit être l’ARN guide
ARNg complémentaire de 17à 20 nucléotides du gène ciblé
cette séquence doit être suivie par une séquence NGG ou NGA appelée PAM (N=nptq nucléotide)
l’arn g peut alors former un complexe avec l’adn et la nucléase (cas 9)
pour éviter de couper des séquences d’ADN similaires à celle qui est ciblée
-utiliser une nucléase non fonctionnelle (dCas9) fusionnée avec la nucléase Fok1
-la nucléase Fok1 doit former un dimère pour couper l’ADN
-ce dimère ne peut être formé que si 2 ARNg ciblent des séquences de nucléotides séparées de 13 à 17 nucléotides
exemple utilisation de crispr cas 9 dans certaines pathologies
-dystrophie musculaire de Duchenne
exon 23
-maladie de hutington
régions des triplets CAG dans le gène huntingtin
