PCR (Reacción en cadena de la polimerasa)

Question 1

¿Qué significa PCR?

Answer 1

Reacción en cadena de la polimerasa

Question 2

Técnica de biología molecular cuyo objetivo es la amplificación exponencial y específica de un fragmento de DNA

Answer 2

PCR

Question 3

Pasos de la PCR

Answer 3

1. Una molécula de ADN con una secuencia blanco calentada es copiada por desnaturalización
2. Cuando la mezcla se enfría, los primers se unen a una hebra simple de ADN
3. Los dNTPs y la ADN polimerasa son agregadas para sintetizar dos nuevas cadenas de ADN
4. El proceso es repetido, doblando la cantidad de ADN
5. Por repetición del proceso, muchas copias del ADN original pueden ser producidos en corto tiempo

Question 4

La PCR está basada en (Kary Mullis)

Answer 4

La replicación del DNA
-cadena molde
-DNA polimerasa
-Primers de DNA en pcr

Question 5

Podemos hacer una PCR a partir de DNA:

Answer 5

• DNA genómico
• cDNA (complementario) por una retrotranscriptasa
• Fragmento de DNA
• DNA plasmídico
• Bacteriófago λ **o viral

Question 6

¿Cuáles son los componentes de una reacción?
**master mix

Answer 6

• Buffer de Reacción 100 mMTris (pH 8.3) + 500mM KCl
• MgCl2 1.5 mM (cofactor de enzimas, se une a la polimerasa y hace que se potencialice su función)
• dNTPS 200 μM (generar cadenas de ADN)
• Primer Sentido (F) 200 nM forwards
• Primer Antisentido (R) 200 nM revearse
• Taq-DNA polimerasa 2U/ 25 μl
• DNA que contiene la secuencia a ser amplificada
• 100 ng (cadena de ADN tiene que tener una concentración de esto para poder hacer la pcr)
• Agua libre de DNAsas

Question 7

¿Cuáles son los nucleótidos que tiene el máster mix? dNTP´s:
Hay millones de dNTPs para que la polimerasa tenga suficientes bn para poderlas unir y generar las cadenas nuevas del DNA de forma artificial

Answer 7

• dATP: desoxinucleótido Trifosfato de Adenosina
• dCTP: desoxinucleotido Trifosfato de Citosina
• dGTP: desoxinucleótido Trifosfato de Guanina
• dTTP: desoxinucleótido Trifosfato de Timina

Question 8

La PCR tiene primers o iniciadores de secuencias:

Answer 8

• Los más importantes en la eficiencia y especificidad de la reacción de amplificación

• Deben ser complementarios a la secuencia a amplificar

Question 9

Las secuencias de los primers o iniciadores de secuencia pueden medir (cortas)

Answer 9

18 y 25 pb
Se híbridan para la cadena complementaria que se quiere amplificar y esto puede ocurrir a una temperatura de 50-60°C

Question 10

Termociclador se programa y al momento en que el equipo está entre 50-60°C

Answer 10

Los primers se hibridan

Question 11

Desde donde se amplifica la pcr

Answer 11

Primer forward al Primer revearse
(Desde esta parte la polimerasa pega nucleótidos)
500 pb en la banda si no coincide es inespecifica

Question 12

Anteriormente se usaba la polimerasa de

Answer 12

E. Coli

Question 13

El ADN se desnaturaliza a más de **

Answer 13

90°C

Question 14

La Taq-DNA polimerasa es una enzima purificada (clonada) de la bacteria

Answer 14

Thermus aquaticus (en heizers)

Question 15

La Taq-DNA polimerasa tiene una actividad óptima de 72°C pero es altamente estable a

Answer 15

94-95°C

Question 16

La Taq-DNA polimerasa a que temperatura pega nucleotidos
Cuando el termociclador está a X temperatura genera la cadena de ADN

Answer 16

72°C

Question 17

La Taq-DNA polimerasa
Cantidad y extiende

Answer 17

-Cantidad: 1-2 U / 25 μl reacción de PCR
-Extiende 2-4 kb por minuto (35-70 bases seg).

Question 18

Pasos de la PCR (polymerase chain reaction)

Answer 18

1. Desnaturalización del ADN (95°C) 【ADN se separa los puentes de hidrogeno】
2. Alineamiento de los primers o hibridación (50-70°C) 【separado el ADN se baja la t, se hibrida la secuencia que queremos amplificar】
3. Elongación o extensión de la polimerasa (72°C)
   【sube la t, una vez hibridados los primers la polimerasa llega y empieza a pegar nucleotidos】y luego *** tenemos la cadena nueva de ADN

**nueva plantilla de ANDds
Se repite de manera cíclica 25 ciclos más o menos

Muestra de ADN se agrega el master mix
El termociclador hace las 3 temperaturas y las lleva de manera cíclica

Question 19

V o F
Se amplifica en la pcr solo una pequeña porción

Answer 19

Verdadero 【si es más ADN es técnica de secuenciacion】
Amplificación exponencial 25-32 **despues de 32 ciclos se obtienen billones de copias

Question 20

V o F
Análisis de los productos de PCR por medio de electroforesis

Answer 20

Verdadero

Question 21

¿Qué se evalua en medicina legal por PCR?

Answer 21

Polimorfismos STR (short tandem repeats)

Question 22

La mayoría de nuestro ADN es idéntico al de otras personas. Sin embargo, hay regiones heredadas de nuestro ADN que pueden variar de una a otra persona. Las variaciones de la secuencia del ADN entre individuos se denominan

Answer 22

polimorfismos (STR] 1%

Question 23

son secuencias cortas de ADN, normalmente con una longitud de 2 a 5 pares de bases, que se repiten muchas veces de forma consecutiva, por ejemplo, la secuencia de 16 pb “gatagatagatagata” representaría 4 copias dispuestas de principio a fin del tetrámero “gata”

Answer 23

Short Tandem Repeats (STR)

Question 24

V o F
Los polimorfismos en STR se deben al distinto
número de copias del elemento repetido que puede aparecer en una población de individuos

Answer 24

Verdadero

Question 25

Usos de la PCR

Answer 25

Medicina legal
Pruebas de paternidad

Question 26

V o F
De acuerdo a la cantidad de STR que tenemos es es lo que nos hace diferente

Answer 26

Verdadero

Question 27

D7S280 es uno de los 13 loci genéticos STR del núcleo CODIS. Este ADN se encuentra en:

Answer 27

el cromosoma 7 humano

Question 28

A continuación se muestra la secuencia de un alelo representativo de este locus. Esta secuencia procede de __________, una base de datos de ADN pública.

La secuencia tetramérica repetida en D7S280 es “gata”. Alelos diferentes de este locus tienen entre __ y __ repeticiones en tándem de la secuencia “gata”.

Answer 28

GenBank

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