PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) Flashcards
¿Qué significa PCR?
Reacción en cadena de la polimerasa
Técnica de biología molecular cuyo objetivo es la amplificación exponencial y específica de un fragmento de DNA
PCR
Pasos de la PCR
- Una molécula de ADN con una secuencia blanco calentada es copiada por desnaturalización
- Cuando la mezcla se enfría, los primers se unen a una hebra simple de ADN
- Los dNTPs y la ADN polimerasa son agregadas para sintetizar dos nuevas cadenas de ADN
- El proceso es repetido, doblando la cantidad de ADN
- Por repetición del proceso, muchas copias del ADN original pueden ser producidos en corto tiempo
La PCR está basada en (Kary Mullis)
La replicación del DNA
-cadena molde
-DNA polimerasa
-Primers de DNA en pcr
Podemos hacer una PCR a partir de DNA:
• DNA genómico
• cDNA (complementario) por una retrotranscriptasa
• Fragmento de DNA
• DNA plasmídico
• Bacteriófago λ **o viral
¿Cuáles son los componentes de una reacción?
**master mix
• Buffer de Reacción 100 mMTris (pH 8.3) + 500mM KCl
• MgCl2 1.5 mM (cofactor de enzimas, se une a la polimerasa y hace que se potencialice su función)
• dNTPS 200 μM (generar cadenas de ADN)
• Primer Sentido (F) 200 nM forwards
• Primer Antisentido (R) 200 nM revearse
• Taq-DNA polimerasa 2U/ 25 μl
• DNA que contiene la secuencia a ser amplificada
• 100 ng (cadena de ADN tiene que tener una concentración de esto para poder hacer la pcr)
• Agua libre de DNAsas
¿Cuáles son los nucleótidos que tiene el máster mix? dNTP´s:
Hay millones de dNTPs para que la polimerasa tenga suficientes bn para poderlas unir y generar las cadenas nuevas del DNA de forma artificial
• dATP: desoxinucleótido Trifosfato de Adenosina
• dCTP: desoxinucleotido Trifosfato de Citosina
• dGTP: desoxinucleótido Trifosfato de Guanina
• dTTP: desoxinucleótido Trifosfato de Timina
La PCR tiene primers o iniciadores de secuencias:
• Los más importantes en la eficiencia y especificidad de la reacción de amplificación
• Deben ser complementarios a la secuencia a amplificar
Las secuencias de los primers o iniciadores de secuencia pueden medir (cortas)
18 y 25 pb
Se híbridan para la cadena complementaria que se quiere amplificar y esto puede ocurrir a una temperatura de 50-60°C
Termociclador se programa y al momento en que el equipo está entre 50-60°C
Los primers se hibridan
Desde donde se amplifica la pcr
Primer forward al Primer revearse
(Desde esta parte la polimerasa pega nucleótidos)
500 pb en la banda si no coincide es inespecifica
Anteriormente se usaba la polimerasa de
E. Coli
El ADN se desnaturaliza a más de **
90°C
La Taq-DNA polimerasa es una enzima purificada (clonada) de la bacteria
Thermus aquaticus (en heizers)
La Taq-DNA polimerasa tiene una actividad óptima de 72°C pero es altamente estable a
94-95°C
La Taq-DNA polimerasa a que temperatura pega nucleotidos
Cuando el termociclador está a X temperatura genera la cadena de ADN
72°C
La Taq-DNA polimerasa
Cantidad y extiende
-Cantidad: 1-2 U / 25 μl reacción de PCR
-Extiende 2-4 kb por minuto (35-70 bases seg).
Pasos de la PCR (polymerase chain reaction)
- Desnaturalización del ADN (95°C) 【ADN se separa los puentes de hidrogeno】
- Alineamiento de los primers o hibridación (50-70°C) 【separado el ADN se baja la t, se hibrida la secuencia que queremos amplificar】
- Elongación o extensión de la polimerasa (72°C)
【sube la t, una vez hibridados los primers la polimerasa llega y empieza a pegar nucleotidos】y luego *** tenemos la cadena nueva de ADN
**nueva plantilla de ANDds
Se repite de manera cíclica 25 ciclos más o menos
Muestra de ADN se agrega el master mix
El termociclador hace las 3 temperaturas y las lleva de manera cíclica
V o F
Se amplifica en la pcr solo una pequeña porción
Verdadero 【si es más ADN es técnica de secuenciacion】
Amplificación exponencial 25-32 **despues de 32 ciclos se obtienen billones de copias
V o F
Análisis de los productos de PCR por medio de electroforesis
Verdadero
¿Qué se evalua en medicina legal por PCR?
Polimorfismos STR (short tandem repeats)
La mayoría de nuestro ADN es idéntico al de otras personas. Sin embargo, hay regiones heredadas de nuestro ADN que pueden variar de una a otra persona. Las variaciones de la secuencia del ADN entre individuos se denominan
polimorfismos (STR] 1%
son secuencias cortas de ADN, normalmente con una longitud de 2 a 5 pares de bases, que se repiten muchas veces de forma consecutiva, por ejemplo, la secuencia de 16 pb “gatagatagatagata” representaría 4 copias dispuestas de principio a fin del tetrámero “gata”
Short Tandem Repeats (STR)
V o F
Los polimorfismos en STR se deben al distinto
número de copias del elemento repetido que puede aparecer en una población de individuos
Verdadero
Usos de la PCR
Medicina legal
Pruebas de paternidad
V o F
De acuerdo a la cantidad de STR que tenemos es es lo que nos hace diferente
Verdadero
D7S280 es uno de los 13 loci genéticos STR del núcleo CODIS. Este ADN se encuentra en:
el cromosoma 7 humano
A continuación se muestra la secuencia de un alelo representativo de este locus. Esta secuencia procede de __________, una base de datos de ADN pública.
La secuencia tetramérica repetida en D7S280 es “gata”. Alelos diferentes de este locus tienen entre __ y __ repeticiones en tándem de la secuencia “gata”.
GenBank
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