PCR Flashcards
Quelles sont les 3 étapes de la PCR?
1- dénaturation de l’ADN (95* pour 30-60 secondes)
2- hybridation des amorces (Tm-5* pour 30-60 secondes)
3- Polymérisation (72* pour 30 secondes à quelques minutes)
Quels sont les “ingrédients” constituants la matrice?
- Les fragments d’ADN complets
- Le couple d’amorces
- l’ADN polymérase thermorésistante
- des DNTPs (ATGC)
Quelles sont les caractéristiques importantes de la taq polymérase?
Outre le fait qu’elle soit thermorésistante:
- Elle synthétise seulement dans le Sens 5’ -> 3’
- Elle ne peut polymériser que si elle a une extrémité 3’-OH provenant de l’amorce (ce qui évite quelle polymérise à partir de n’importe quel endroit Du gène.
- Sa seule matrice est de l’ADN (elle ne multiplie pas les amorces)
Quelles sont les caractéristiques importantes des amorces?
- une Tm semblable à 1-2 degrés près.
- elles encadrent le fragment à multiplier entre leurs 2 extrémités 5’
- il y a toujours 2 amorces: l’amorce sens et celle anti-sens. Elles ont une séquence différente.
En plus de la matrice, quels sont les éléments dans le tube réactionnel pour une PCR?
- Un tampon au PH basique
- Les cofacteurs de la taq-polymérase: MgCl2
Quel est le problème lors de l’hybridation des amorces si le mélange est trop chaud?
Trop peu d’amorces se lient et on a une multiplication plus lente.
Mais la liaison est plus spécifique.
Quel est le problème lors de l’hybridation des amorces si le mélange est trop froid?
L’hybridation est moins spécifique
Quelle est la formule théorique décrivant le nombre de fragments obtenus en fonction de “n” le nombre de cycles de PCR?
Quelle est le rendement réel?
2^n en théorie
1,9^n en réalité
Comment différencier 2 individus a l’aide de la PCR?
On peu utiliser des amorces encadrant les télomères (séquences répétés de longueur variable entre les individus).
Après les avoir isolés et multipliés on fait une migration sur gel pour en connaitre la longueur.
Comment fonctionne la PCR lié à la RFLP?
Polymorphisme de longueur de fragments de restriction.
- On isole et multiplie un gène particulier pour tester la présence d’un site de restriction particulier.
- On doit isoler le gène, car si on test tout le génome on est certain d’avoir un résultat positif, mais mous ne saurons pas d’où il vient.
Comment la PCR est utile au clonage moléculaire?
Elle permet d’obtenir plusieurs copies du même fragment d’ADN, même si l’échantillon initial était hyper petit on peu ensuite faire plusieurs expériences, même destructives, sur l’ADN.
Qu’est-ce qui a permis l’automatisation de la PCR?
La découverte de la taq-polynérase: une enzyme thermorésistante
