Outils En Biomol Flashcards
En quoi consiste l’approche non ciblé?
Ce sont les actions répétitives, de routine.
Des contrôles sans objectif de découverte.
Donnez des exemples de manipulations en lien avec l’approche non ciblé.
Séquençage d'ADN Migration sur gel Observations au microscope Stokage Mutagenèse aléatoire (UV) Culture de cellules
Quel son les objectifs de l’approche intégré?
Ce type d’approche a pour but d’obtenir une vue d’ensemble à un instant T.
Pour pouvoir comparer avec une référence
Donnez des exemples de manipulations en lien avec l’approche intégré.
Suite à une mutagenèse aléatoire (non-ciblé) -> obtenir le protéome ou le transcroptome de la cellule
En quoi consiste l’approche ciblé?
Ce sont des manipulations faites dans un but précis.
On cherche a obtenir un résultat exact pour répondre à une question.
Donnez des exemples de manipulations en lien avec l’approche ciblé.
Détection de séquences précise d’ADN (PCR, hybridation)
Isolation de composantes cellulaires
Mutagenèse dirigé
Quantification de l’activité d’une enzyme
De quoi sont composés les acides nucléiques?
Ce sont de longues chaines de nucléotides
Un nucléotide est composé d’une base azoté + une sucre + un phosphate.
Comment appel-t-on la molécule formé d’un sucre et d’une base azoté?
Comment appeler la même molécule si on ajoute un phosphate au sucre?
Et 2-3 phosphates?
Sucre + base = nucléoside
+ phosphate = nucléotide (monophosphate)
+ 2/3 phosphates = nucléotide di/triphosphate
Comment son nommés les bases azotés comportant un seul cycle?
Pyrimidines
T, U, C
Comment son nommés les bases azotés comportant 2 cycles?
Purines
A, G
Quel groupement est différent entre un ribose et un désoxyribose?
Le ribose a un groupement hydroxyde en C3 et en C2
Le désoxyribose en a seulement un en C3
Quelles sont les 4 étapes pour isoler le matériel génétique (ADN/ARN) d’une cellule vivante?
1- Lyse chimique ou physique de le cellule. Le SDS-NaOH est efficace.
2- centrifugation pour éliminer les débris cellulaires (culot). On garde le liquide.
3- Élimination des protéines à l’aide de solvants. Elles sont précipités et on garde seulement le liquide avec l’ADN toujours en solution.
4- précipitation des acides nucléiques (ADN + ARN) par des sels et des l’alcools pour les concentrer.
Comment savoir quels sont les gènes utilisés par une cellule Eucariote après avoir extrait son matériel génétique?
Les ARNm représentent les sections d el’ADN qui sont transcrites.
On les isoles par chromato d’affinité dans une colonne.
Quelles sont les 3 étapes pour isoler l’ADN plasmique de bactéries?
1- lyse des cellules par SDS-NaOH
2- précipitation de l’ADN génomique et des protéines par l’Acétate de sodium.
3- centrifugation pour séparer les débris (culot) des plasmides en solution.
Expliquer l’électrophorèse.
- Gel d’agarose
- Molécules longues ralentis
- SDS-page pour dénaturer l’ADN et le charger négativement
- Bromure d’éthidium (intercalant) pour voir les migration (barres) aux UV
- migration causé par un champs électrique
- utilisation d’un marquer de poids moléculaires (échelle log)
Comment suivre la séparation des brins d’ADN pendant l’augmentation de la température?
En mesurant son absorbance.
Une molécule sb a une absorbance supérieure.
Qu’es ce que la Tm? Comment la calculer?
Température à laquelle 50% de l’AND est simple brin.
Tm = 2(A+T) + 4(G+C)
En quoi consiste une hybridation moléculaire?
Utilisation d’une sonde de séquence complémentaire à celle que nous voulons isoler.
La sonde est marqué, on peu donc la retrouver (radioactivité)
Quelle est la différence entre un Southern-blot et un Northern-blot?
South = sonde ADN North = sonde ARN
Le reste des manip est pareil
Quelles sont les 3 étapes d’une hybridation moléculaire a partir d’une migration sur gel?
1- on prend le gel avec l’ADN migré et on transfert par capillarité les fragments d’ADN sur une membrane
2- On place la membrane dans un tampon contenant la sonde à la température di Tm pour permettre son hybridation
3- rinçage de la membrane pour éliminer les sondes non liés.
4- Révélation de la sonde par rayons X
Comment se fait le transfert de l’ADN du gel à la membrane?
- On place le gel sur une éponge dans une solution tampon
- la membrane de nylon/microcellulose est mise sur le gel et du papier sec est ajouté par dessus
- le tampon seras absorbé par le papier et devras traverser le gel et la membrane.
- il transporteras les fragments d’ADN avec lui qui serons interceptés par la membrane
Que nous indique la révélation de la sonde dans une hybridation?
Si des bandes apparaissent on sais que la séquence complémentaire à notre sonde se trouve dans les fragments d’ADN ayant migrés à cette distance.
Nommez une utilité des sondes in vivo.
On peut injecter des sondes dans un organisme en développement pour identifier l’expression de certain gènes pendant le développement et leur localisation.
Quels sont les 3 types de démarches expérimentales?
Approche ciblé
Approche non ciblé
Approche intégré
En quoi consiste le clonage moléculaire?
1- Isoler un gène d’intérêt
2- l’insérer dans un vecteur
3- introduire le vecteur dans une cellule qui vas exprimer le produit du gène
4- recueillir la protéine produite
Nommez 2 manières d’isoler un gène pour l’introduire dans un vecteur.
PCR
Hydrolyse enzymatique
Qu’es-ce qu’une endonucléase de restriction?
C’est une enzyme qui hydrolyse le double brin d’ADN si elle reconnais une séquence nucléotidique particulière appelé site de restriction de l’enzyme.
Comment sont nommés les enzymes de restriction?
1e lettre = Genre bactérien
2-3e lettres = Espèce
4e lettre = souche bactérienne ou chiffre romain (ordre de découverte)
Quelle est la différence entre les 3 types d’enzymes de restriction?
Type I: coupe à ~1000 bases du site reconnu. C site est dissymétrique.
Type II: coupe dans le site de reconnaissance. Ce site est un palindrome
Type III: coupe à ~ 10 bases du site reconnu. Ce site est dissymétrique.
Une enzyme de type II coupant entre le nucléotide 1 et 2 du site de reconnaissance créeras quel genre de bout?
3’ protubérant
Peut-on introduire un gène Eucariote dans une cellule procariote?
Oui c’est possible.
Mais la protéine produite ne serviras a rien car les bactéries ne font pas d’épissage, donc nous n’obtiendras la protéine qu’une cellule Eucariote aurais produite.
Quels sont les 5 types de vecteur utilisés, la longueur des fragments qu’ils peuvent accueillir et leur source?
5-10kpb = plasmide bactérien 10-20kpb = ADN viral 20-50kpb = cosmide artificiel 50-100kpb = chromosome BAC artificiel 100-1000kpb = chromosome YAC artificiel
Quelles sont les caractéristiques des plasmides?
- Ce sont des molécules extrachromosomiques facultatives
- ils ont une réplication autonome
- longueur de 0-100kpb
- 10 à 100 plasmides par cellule.
Quels sont les deux types de plasmides et ce qui les différentient dans leur mode de réplication?
Plasmides stringeants:
Réplication cordonné à celle du chromosome.
Souvent plus gros et en plus faible nombre.
Plasmides relâchés:
Réplication non cordonné à celle de la cellule. Souvent plus petit et nombreux.
Quels sont les deux types de plasmides et ce qui les différentient dans leur spectre d’hôtes?
Plasmide non-conjugatif:
Ne se réplique que dans un type de cellule.
Plasmide conjugatif:
Peut se répliquer dans un spectre d’hôtes différents
Quel est le genre d’information génétique transporté par un plasmide?
Résistance aux antibiotiques
Synthèse de bactériocines
Facteurs de virulence
Résistance aux ions toxiques
Expliquer le mode de fonctionnement de l’ampicilline et le mécanisme de résistance développé par certaines bactéries.
L’ampicilline inhibe la synthèse de la parois bactérienne.
La β-lactamase hydrolyse le noyau β-lactam de l’antibiotique
Expliquer le mode de fonctionnement de la tétracycline et le mécanisme de résistance développé par certaines bactéries.
La tétracycline inhibe la synthèse des protéines bactériennes en attaquant la sous unité 30s du ribosome
L’antibiotique est activement pompé hors de la cellule par une protéine membranaire.
Expliquer le mode de fonctionnement du chloramphénicol et le mécanisme de résistance développé par certaines bactéries.
Le chloramphénicol inhibe la synthèse des peotéines bactériennes en empêchant la fixation de la sous unité 50s du ribosome
La chloramphénicol acétyl-transférase inactive le chloramphénicol en l’acétylant
Quels sont les deux effets des bactériocines?
Inhiber la croissance des autres bactéries sans les tuer = activité bactériostatique
Tuer d’autres bactéries ou micro-organismes = activité bactériocide
Donnez des exemples d’ion dangereux et le mode de résistance des bactéries.
Les métaux lourds: Ag, Cu, Hg, As
Réduction de la perméabilité de la membrane cellulaire.
Nommez 2 plasmides naturels responsables du transfert de matériel génétique entre les bactéries.
Le plasmide R et le plasmide F
Il est impératif de demander de l’info supplémentaire sur cette matière à un collègue: cours 3 diapos 7-8
Comment fonctionne le transfert de plasmide entre 2 bactéries?
Une bactérie possède un plasmide codant la synthèse de pili sexuels.
Le pili se lie à une autre bactérie et se rétracte de manière à coller la membrane des deux bactéries.
Il y a copie du plasmide dans la bactérie attiré. Puis elles se séparent.
Les deux bactéries ont maintenant le plasmide et un pili sexuel.
Expliquer le mécanisme général d’infection des cellules de plante (formation de tumeur).
Agrobactérium tumefaciens possède le plasmide:
1- Le plasmide permet d’injecter l’ADNt du plasmide dans une cellule végétale.
2- l’ADN traverse le noyaux et s’intègre dans l’ADN de la plante.
3- cela fait produire des facteur de croissance à la cellule infecté et induit sa multiplication incontrôlé.
En quoi consiste la vectorologie?
Création de vecteurs artificiels ayant des capacités spécifiques
- insertion de longs fragments d’ADN
- détection des cellules avec plasmide recombinant ou non
- augmentation du nombre de sites de restriction uniques
Expliquer le fonctionnement de la sélection négative.
1- croissance des cellules sur MM+ampicilline, les bactéries sans plasmide meurent.
2- réplique au velours dans un MM+tétracycline. Les bactéries recombinantes meurent.
3- les bactéries que nous voulons sont celles vivantes dans le premier pétri, mais pas dans le second.
C’est quoi un MSC?
Sa sert à quoi un MSC?
Multi cloning Site
C’est une suite de 60-100bases qui contient une maximum de sites de restriction. Ces sites ne doivent absolument pas se trouver autre-part sur le plasmide.
Le MSC est placé dans la section codant le peptide alpha (sans empêcher sa synthèse)
Le peptide alpha est une des 2 moitiés de la β-galactosidase.
Le MSC augmente le nombre d’enzymes de restriction utilisable et permet de différencier les bactéries recombinantes ou non par la sélection blanc-bleu
Qu’est-ce que la sélection blanc bleu?
C’est un mode de sélection positive.
Les colonies sont cultivés sur un MM+ampicilline puis MM+simililactose et Xgal
Ampicilline: tue les bactéries sans plasmide
SimiliLactose: active la production de β-galactosidase sans pourtant être métabolisé (donc réutilisable)
X-gal: est transformé en un composé bleu pas la β-galactosidase intacte
Les colonies b’anches sont celles que nous voulons
Qu’es-ce qu’un opéron?
Un gène codant plusieurs protéines à partir d’une seule origine de réplication.
On en retrouve seulement chez les procariotes
Qu’est-ce qu’un ARNm polycistronique?
Un ARMm codant plusieurs protéines différentes une à la suite de l’autre.
Quelles sont les sections composant l’opéron lactose?
Lac I = gène de régulation, plus loins sur le chromosome
P = site du promoteur Or = origine de réplication Lac z = β-lactosidase Lac Y = perméase au lactose Lac A = thiogalactoside transacétylase
Comment l’opéron lactose est activé?
En temps normal (glucose) Lac I code des protéines qui, en tétramère, se lient à Or et le bloque
L’entrée de lactose inhibe les protéines bloquant la traduction.
La bactérie code donc les protéines lui servant à utiliser le lactose comme source de carbone.
Quelles sont les 2 moitiés de la β-galactosidase?
Peptide alpha (contenant MSC) Partie carboxiterminale
Que fait la β-galactosidase, quelle est son activité enzymatique?
Elle hydrolyse la molécule de Xgal en glucose et en un composé bleu
Quels sont les caractéristiques et les avantages du phagemid?
C’est le pBluescript
Dérivé de pUC, un bactériophage
Il a donc tous les outils pour permettre son insertion facile dans les bactéries. Il a une grande efficacité d’insertion.
Quelles son les caractéristiques et les avantages du vecteur navette?
Un vecteur navette comporte les éléments nécessaires à sa reproduction chez les bactéries (procariote) comme les levures (eucariote)
Quelles sont les étapes d’un clonage moléculaire?
1- Amplification du gène d’intérêt par PRC
2- Mélange de vecteurs et de 3x plus d’inserts dans un tampon.
3- Insertion du gène dans un vecteur grâce à l’ADN ligase et à des enzymes de restriction
4- Insertion du vecteur dans des cellules hôtes qui vont exprimer le produit du gène.
Quel et le nom de l’insertion chez une cellules procariote? Et chez un eucariote?
Transformation procariote
Transflexion eucariote
Quelle est la différence entre une bactérie compétente et les autres?
La bactérie compétente est possible à conserver à -80 degrés celcius
Quelles sont les étapes de la réaction de transformation?
1- On a des bactéries en solution aqueuse, sur la glace.
2- on ajoute les plasmides recombinés ans le tube contenant les bactéries.
3- choc thermique! 42 degrés pendant 2 minutes) ou choc électrique: la membrane bactérienne devient perméable aux plasmides.
4- 30-60 minutes à 37 degrés celcius pour permettre aux bactéries d’exprimer les gènes de leur plasmide.
5- étalement sur un MM+ampicilline.
6- étalement des colonies survivantes sur un MM+Xgal+IPTG(faut lactose)
Quelles sont les étapes du séquençage d’un génome entier?
1- digestion partielle du matériel génétique (on ne laisse pas les enzymes couper tous leurs sites)
2- insertion des différents fragments toujours dans un même vecteur.
3- transformation bactérienne
4- étalement des bactéries sur un milieu de culture pour identifier celle recombinantes
5- extraction et purification de l’ADN plasmidique
6- réaction de Sander avec des colonies séparés pour séquencer séparément les fragments
Quelle enzyme peut on utiliser pour un séquençage de génome et quel est son avantage?
SAU3A1
Sont site de reconnaissance comporte seulement 4 bases elle vas donc couper l’ADN en plus petit fragments.
(Tous les 4^4=256 bases en théorie)
N = ln(1-P)/ln(1-f)
Que signifient les lettres?
P = probabilité désiré d’obtenir une certaine séquence dans une banque de fragments d’un génome.
f = taille de chaque fragments (en moyenne) p/r à la taille du génome entier.
Ex: fragment de 10 bases dans un génome de 1000 bases: f=0,1
N = le nombre de colonies recombinantes nécessaire à utiliser
Quel est le principe de la réaction de Sanger?
On utilise une polymérase normale qui a accès à des bases normales et à des bases sans groupement -OH (didésoxynucléotide triphosphates: ddNTPh
Si elle lie un ddNTP, elle arrête de multiplier le brin
Quels son les “ingrédients d’une réaction de Sanger?
La matrice: l’ADN non coupé à séquencer
Une ADN polymérase 5’->3’ dépendante d’une extrémité 3’-OH
Plusieurs copies d’une amorce qui se fixe à une section connue du vecteur juste avant l’insert.
Les dNTP normaux Des ddNTP (séparés dans 4 tubes)
Un tampon
Comment se lit une migration sur gel à la suite d’une réaction de Sanger?
On obtient la séquence des bases complémentaire au brin utilisé à partir du bas (extrémité 5’)
Chaque colonne représente une base (A, T, C ou G)
Comment séquence-t-on un fragment d’ADN de nos jours?
On multiplie le fragment désiré en utilisant seulement des bases marqués par une couleur.
Un lazer vas lire toute la séquence d’un coup.
