PCR Flashcards
¿En qué se basa la PCR?
En la replicación de una nueva cadena de DNA
¿De qué requiere una PCR?
Secuencia de DNA
Enzima DNA polimerasa
Desoxirribunucleotidos
Primers
Pasos para hacer una PCR
Extracción DNA
Se coloca en un tubo
Se agrega → primers, DNA polimerasa, cofactores y nucleotiodos
Termociclado
Función primers
Reconocen secuencias blanco en DNA molde
Transcriben desde 3´
Ricos en GC
Fases del termociclado
Desnaturalización → separación de las cadenas, 95º
Hibridación → aliniación primers en 3´, 50º-60º
Extensión → Taq polimerasa actua sobre primers agregando nucleotidos, cadenas complementarias, 72º
40 ciclos
Electroforesis
Separación de moléculas de distinto peso al ser sometidas a un campo eléctrico.
Elementos
Camara de electroforesis
Gel de agarosa → - = poros +
Transiluminador ultravioleta
qPCR
PCR en tiempo real o PCR-TR
* Con cada ciclo se detectan los productos amplificados
* Se usan tinciones o sondas con fluoróforos para detectar fragmentos amplificados
* Cuantificación de la calidad DNA (carga o expresión de genes).
Método más sensible para detectar y cuantificar los ácidos nucleicos
qPCR
Sonda
Secuencia de nucleoótidos del gen de interes
Sistema reportero flourescencia
qPCR
Específico → secuencia complementaria
Sonda flourescente de oligonucleótidos con reportero flourescente
No específico → Se intecala en doble cadena
Moléculas intercalants con afinidad por el dsDNA, genera señal flourescente SYBER Green
PCR estándar
Cualitativa → presencia o ausencia
PCR múltiple
Detección cualitativa de distintos genes
PCR-RFLP
Restrictión fragment lenght polymorphism
PCR-RT
ARN → cADNA
Detección de virus
¿Cuál es la función de los primers en la PCR?
Flanquean la región de ADN a amplificar; el forward va 5’→3’ y el reverse 3’→5’.
¿Qué enzima se usa en la PCR y por qué?
Taq polimerasa, porque resiste temperaturas de hasta 95°C.
¿Cuáles son las fases de un ciclo de PCR?
Desnaturalización (95°C), hibridación (50-60°C) y extensión (72°C).
¿Qué es la electroforesis en gel?
Técnica que separa fragmentos de ADN, ARN o proteínas según su tamaño mediante un campo eléctrico.
¿Para qué sirve el marcador de peso molecular en electroforesis?
Para comparar el tamaño de los fragmentos de ADN de las muestras.
¿Qué se utiliza para visualizar el ADN en gel?
Tinción con bromuro de etidio o SYBR Green bajo luz ultravioleta.
¿Qué permite la qPCR?
Detección y cuantificación del ADN amplificado en cada ciclo.
¿Cuál es la diferencia entre qPCR específica y no específica?
La específica usa sondas fluorescentes; la no específica usa moléculas intercalantes como SYBR Green.
¿Cuál es el método más confiable para detectar material genético?
qPCR.
¿Qué es la secuenciación de Sanger?
Técnica para determinar la secuencia exacta de nucleótidos en una molécula de ADN.
