Análisis de ácidos nucleicos Flashcards
Extracción de ADN
primer paso para la clonación, secuenciación, PCR y análisis de mutaciones.
Pregunta
Respuesta
¿De qué depende el método de extracción?
Tipo de ácido nucléico
Organismo de origen
Fuente de origen
Técnica a usar
Extracción de DNA técnica de fenol-cloroformo
- Lisis y liberación de DNA
- Cloruro de amonio → Lisis de eritrocitos → SDS → Lisis de membranas celulares y nucleares - Extracción de proteínas y lípidos con solventes orgánicos → fenol + cloroformo + alcohol isosalámico
- Fase orgánica: lípidos, proteína y debris celulares
- Fase acuosa: ácidos nucleicos - Precipitación de DNA: solución salina salturada (desnaturaliza proteínas) y etanol 100% (precipita DNA)
- Lavado del boton de DNA → Etanol 70% (2 veces) + agua
- Centrifugado
- Fase fenólica → buffer Tris (EDTA) → abajo
¿Por qué es necesario eliminan los eritrocitos durante la extracción de ADN?
Interfieren en el análisis de ADN
Compuesto usado para la lisis de membranas y nucleares
SDS (dodecilsulfato sódico)
Función de buffer
Liberar ADN de histonas
Espectrofotometría
Solución con moléculas suspendidas permite el paso de luz
(mayor absorción de luz=mayor concentración)
Fluorometria
Unión específica de colorantes flourescentes entre las cadenas del ácido nucleico
Absorbe luz con una longitud de onda y emite una superior
Por qué se usa la DNA polimerasa
Taq
95º
Polimerisa una cadena de DNA a partir de una preexistente
Cofactor de la Taqpolimerasa
Cloruro de magnesio
Función de amortiguador
pH aducuado 8.4
¿Qué permite la espectofotometría?
Cuantificar el ADN
¿Qué se usa para la lisis de eritrocitos en el método fenol-cloroformo?
Cloruro de amonio.
¿Qué contiene la fase orgánica durante la extracción con fenol-cloroformo?
Lípidos, proteínas y desechos celulares.
¿Qué contiene la fase acuosa durante la extracción con fenol-cloroformo?
Ácidos nucleicos.
¿Qué se usa para precipitar el ADN?
Solución salina saturada y etanol al 100%.
¿Con qué se lava el ADN para eliminar impurezas?
Etanol al 70% y agua.
¿Cómo se cuantifica el ADN?
Mediante espectrofotometría a 260 nm.
¿Qué indica una relación A260/A280 entre 1.8 y 2.0?
Pureza de ADN.
