mutageneza i sekwencjonowanie Flashcards
megaprimer
dwa pcry, produkt drugiego ma mutację, produkt pierwszego jest megaprimerem
tm
Tm = 64.9C + 41C (G+C-16.4) /(A+T+G+C)
mutageneza przypadkowa
Nie wymaga znajomości wyjściowej sekwencji nukleotydów w genie
Error Prone PCR
wprowadzanie mutacji przez błędny pcr (zmienione polimerazy)
etapy maxima gilberta
- modyfikacja zasady azotowej np. metylacje
- oderwanie zmodyfikowanej zasady
- pęknięcie nici za zmodyfikowaną zasadą
pyrosekwencjonowanie
z zastosowaniem chemiluminescencji
produkt uboczny dołączenia nukleotydu to ppi, lucyferaza katalizuje ostatnią reakcję, pojawia się światło gdy przyłączony nukleotyd
WADA: problem gdy mamy 7 lub więcej powtórzeń
Izoschizomery
rozpoznające te same sekwencje i tnące je w ten sam sposób
neoschizomery
rozpoznające te same sekwencje, ale tnące je w różny sposób
illumina/solexa (z odrwacalną termonacją)
- przygotowanie próbki
- przyłączenie DNA do powierzchni komory
- Amplifikacja DNA (mostkowy PCR)
- Powstają dwuniciowe fragmenty DNA
- Denaturacja dwuniciowego DNA i odpłukanie
- Dokończenie amplifikacji DNA - powstaje wiele kopii tej samej nici
- Identyfikacja pierwszej zasady - wprowadznie mieszaniny 4 wyznakowanych nukleotydów (odrwacalnych terminatorów)
- Odczytanie sygnału emitowanego po identyfikacji zasady
- Identyfikacja drugiej zasady
SOLiD
4 krótkie sondy wyznakowane w jednym miejscu, w tym miejscu różnią się jednym nukleotydem
ion torren system
wprowadza się po jednym rodzaju nuklotydu - zmiania pH gdy przyłączony
WAD: problem jak dużo powtórzonych obok siebie
nanosekwencjonowanie
nanopor - kanał białkowy
helikaza rozplata - tylko jedna nić
sygnał elektryczny
Cykliczne sekwencjonowanie (Sanger + PCR)
PCR z wyznakowanymi ddNTP i tylko jednym starterem, aby namnożyć tylko jedną nić- liczba produktów rośnie liniowo
Mieszaninę produktów różnej długości oczyszczamy z niezwiązanych ddNTP
Elektroforeza kapilarna w sekwenatorze- detekcja laserowa fluorochromów- jako wynik elektrofluorogram lub chromatogram
