Molekylärbiologiska metoder Flashcards
Viktigaste verktygen i bioteknik
- Restriktionsenzymer
- Blotting-tekniker
- DNA-sekvensering
- PCR
Vad är restriktionsenzymer?
Grupp av enzymer som agerar försvar mot främmande DNA i prokaryoter. Har förmåga att klyva bindningar i DNA.
En typ av endonukleaser (klyver i mitten) och känner igen plats i DNA som ska klyvas genom längd (ofta palindromsekvens)
Vad genererar klyvning med restriktionsenzymer?
Blunt-ends = inget överhäng, båda kedjor blir längre
Sticky-ends = överhäng, ena kedjan blir längre
Nämn restriktionsenzymers användningsområden i labb
- Analys av kromosomstruktur
- Sekvensering av långa DNA-kedjor
- Isolering av gener
- Skapa nya DNA-molekyler som kan klonas
Vad är agarosgelelektrofores?
- Typ av elektrofores-metod som används för att visualisera specifikt DNA som separerats med restriktionsenzymer
Beskriv metoden agarosgelelektrofores
- DNA är negativt laddat och kommer röra sig mot den positivt laddade anoden
- Kortare DNA-fragment rör sig längre i gelen
- PAGE används för fragment mindre än 100 bp
Vad är DNA-ligas?
Grupp enzymer som sammanfogar olika beroende på om det är blunt- eller sticky-ends (sticky-ends kan baspara innan de blir sammanfogade av ligaser)
Vad är vektorer?
- “Fordon” som överför genetiskt material till en värdcell
- Främmande DNA limmas mha DNA-ligas för att kunna överföras på ett för värdcellen informativt sätt
Ge exempel på vektorer
Bakteriofager = virus som angriper bakterier
Plasmider = liten cirkulär dubbelsträngad DNA-molekyle som kan replikeras oberoende inuti en bakteriecell
Vilka egenskaper krävs för att plasmider ska vara lämpliga för kloning?
- Måste finnas en plats där önskat DNA kan ligeras = klonings-site
- Måste finnas genetic marker (t.ex. specifik gen mot antibiotikaresistens)
- Måste kunna replikeras på specifik plats i värdcellen = Ori (origin of replication)
Vad är transformering?
- Bakterieceller tar upp plasmider som finns i den omgivande lösningen
- Lättare att ta upp plasmiderna om bakterierna befinner sig i tillväxtfas
Hur sker transformering?
- Celler behandlas med iskall kalciumklorid-lösning och placeras sedan varmt under några minuter (heat-shock). Plasmider kan nu ta sig in i bakteriecellerna
Vad är AmpR-gen?
Används för att se vilka bakterieceller som genomgått transformering, dvs i de plasmider gått in.
Bakteriekultur placeras i en agarplatta med antibiotika. Celler med plasmiden tas upp medan resten dör. AmpR-gen ger en selektion.
Vad är blue-white screening?
- Selektion baserat på LacZ-gen som kodar för proteinet β-galaktosidas.
- Istället för laktos används IPTG i labb som är en laktosanalog ej nedbrytbart av β-galaktosidas
- X-gal tillsätt också, den bryts ned av β-galaktosidas och blir ett blått färgämne
- Metoden används för att identifera vilka plasmider som ‘r “tomma” och de rekombinanta
- Blå koloni = “tomma” plasmider, fungerande lacZ-gen
- Vit koloni = rekombinanta plasmider, inaktiverad lacZ-gen
Vad är cDNA?
Complementary DNA, bildas när enzymet omvänt transkriptas bildar en DNA-kedja utifrån en mRNA-molekyl som mall
Vad är PCR?
Polymerase Chain Reaction
- Metod för att amplifiera en enda DNA-molekyl
Vad finns i en master solution (PCR)?
Mall = DNA-molekyl
Primers (kort nukleinsyrasekvens där replikation kan starta)
DNA-polymeras som är värmestabilt
dNTP:s
Beskriv PCR steg för steg (viktigt med temp)
- Blandning värms upp till ca 95°C. Komplementära strängar i DNA-molekyl separeras, molekylen denatureras
- Temperatur sänks till ca 40°C och primers 1 & 2 binder in
- Temperaturen högs till 72°C, DNA-polymeras binder till DNA-strängarna och startar kopiering genom att utgå från primern och foga ihop fria nukleotider
- Temperaturcykel upprepas tills tillräckligt mycket DNA-material har bildats. För varje gång bildas kopior av DNA-molekylerna
Användningsområden för PCR
- Diagnostisering av genetiska sjukdomar
- Diagnostisering av smittsamma sjukdomar, t.ex. HIV
- Arkeologisk analys
Vad är Sangers metod för sekvensering?
Metod som kan användas för att exakt sekvensbestämma en DNA-kedja
Beskriv Sangers metod för sekvensering
Lösning innehåller:
- DNA som skall sekvensbestämmas
- DNA-polymeras
- ddNTPs märkta med olika “färger”
- dNTPs
- Primer
- Lösning får genomgå PCR → replikation av nya DNA-strängar kommer sluta där ddNTPs fäster, dvs DNA-strängar blir olika långa
- DNA strängar med samma färg, dvs märkta med samma ddNTP, får gå igenom samma brunn i gelelektrofores
- Långa DNA-strängar vandrar kortast i gelen
- Korta vandrar längst
- Exakt ordning av kvävebaser i DNA-strängen kan avläsas
Vad är Blotting-tekniker?
Det är metoder för att identifiera specifika sekvenser av DNA/RNA.
DNA/RNA-band på geler kan överföras till nitrocellulosafilter och identifieras mha hybridisering (basparning) med en specifik probe.
Southern blotting = identifiera specifika sekvenser DNA
Northern blotting = identifiera specifika sekvenser RNA
Beskriv blotting steg för steg
- Gelelektrofores av en lösning med DNA-fragment som har klippts av restriktionsenzymer
- DNA-fragment överförs till ett membran (blotting-stage). Även en DNA-sekvens komplementär mot den sekvens man vill identifiera placeras på membran (=DNA-probe). DNA-probe är märkt med något som går att identifiera (flourscently tagged)
- Överskottet av DNA probe tvättas bort från membranet
- Autoradiografi, dvs röntgen av membranet → om gen man var ute efter finns i provet kommer streck synas på membranet
Vad är VNTR?
- Variable Number of Tandem Repeats, icke-kodande sekvenser (introner) i DNA som upprepas ett stor antal gånger.
- Utgör ca 30% av genomet
- Antalet upprepningar av VNTR är unikt för varje individ
Vad är DNA-fingerprinting?
Kan involvera flera olika metoder (bl a Southern blotting).
Används vid brottsutredning. Blod från gärningsman och offer kan jämföras för att se om en person är skyldig. Avgörs med gelelektrofores. Sannolikhet att det blir fel är 1 på 33 miljarder
Vad är RNA interference?
Metod för att inaktivera genuttryck
- Dubbelsträngat RNA införs i cell → klyvs i små framgent av enzymerna dicers
- Små fragment kallas siRNA (small interfering RNA)
- siRNA kommer binda till mRNA inne i cellen → translation kan ej ske
- Kommer inte påverka DNA, utan endast tillfälliga uttrycket av specifika proteiner
