Module 8 - PCR/VNTR Flashcards
Qu’est-ce que la PCR permet de faire?
La PCR permet de choisir un segment d’ADN dans un génome et d’amplifier cette séquence de manière exponentielle afin d’en obtenir des millions de copies.
Quelles sont les caractéristiques de l’ADN polymérase Taq et quel est son rôle?
L’ADN polymérase Taq a été isolée à partir de la bactérie thermophile Thermus aquaticus. Sa température optimale est à 72°C et peut résiter aux température élevées (95°C). C’est donc une enzyme qui résiste très bien à la chaleur. Son rôle est de polymériser des chaînes d’ADN ne dépassant pas généralement 4 kb.
Combien de copies obtient-on à la fin d’une polymérisation.
Puisque le nombre de copies double à chaque cycle, on obtient 2 exposant n copies, n étant le nombre de cycles. La séquence cible augmente donc de façon exponentielle. La formule pour prédire le nombre total de copies de la séquence cible (Y) est Y = x 2 à la n, où x est le nombre initial de copies.
De quelle façon l’ADN polymérase Taq ajoute-elle des nucléotides lors de l’élongation (synthèse du brin complémentaire)?
La polymérase Taq ajoute des nucléotides toujours vers l’extrémité 3’ du nouveau brin synthétisé, donc se déplace de 5’ vers 3’.
Quel appareil est utilisé pour produire des changements de température à chaque cycle?
Un thermocycleur
Quel est l’ordre des températures utilisées pour un protocole typique de PCR?
1) Dénaturation: 95°C pendant 30 à 60 s
2) Hybridation (appariement) des amorces: Température d’appariement (Tm - 5°C) pendant 30 à 60 s; se situe normalement entre 40-65°C
3) Élongation: 72°C pendant 30 à 60 s
Qu’est-ce que représente la température de fusion (Tm)?
C’est la température à laquelle 50% des molécules d’amorce sont associées à la matrice.
Quelle est la relation entre la Tm d’une amorce et sa longueur et son % G+C?
Tm = (4 x nb de G+C) + (2 x nb de A+T)
Donc la Tm est plus élevée lorsque le %G+C augmente et lorsque l’amorce est plus longue. Pour faire varier la température d’appariement, on peut donc jouer avec le nombre de G, C, T et A.
De quoi dépend la durée de l’élongation?
De la longueur de la séquence cible (qui se synthétise à une vitesse de 1 kb/min).
Pourquoi le nombre total de cycle doit être égal ou inférieur à 30?
Parce qu’au-delà de 20 à 25 cycles, l’enzyme Taq polymérase est de moins en moins efficace (passages successifs à 95°C) et la réaction atteint un plateau.
Quelle étape supplémentaire est effectuée à la fin du dernier cycle et pourquoi?
Une étape d’élongation pour s’assurer que la synthèse de tous les brins est complète.
Qu’est-ce qu’une amorce?
Une amorce est une courte séquence d’ADN, complémentaire au début d’une matrice, servant de point de départ à la synthèse du brin complémentaire de cette matrice par l’enzyme ADN polymérase Taq. La séquence des amorces doit toujours être présentée dans l’orientation 5’ vers 3’.
Comment les amorces permettent-elles la spécificité de la PCR?
Les amorces permettent l’amplification spécifique de la séquence comprise entre les extrémités 5’ des deux amorces. Autrement dit, les amorces permettent de définir spécifiquement la séquence de l’amplicon.
Quelles caractéristiques les amorces doivent-elles avoir?
1) Les amorces doivent avoir une Tm semblable (moins de 5°C de différence)
2) L’extrémité 3’ de chaque amorce doit s’apparier parfaitement au gabarit
3) Pour une amplification sur du génome humain, les amorces devraient avoir au moins 17 nucléotides de longueur
4) Les amorces doivent avoir une longueur entre 15 à 35 nucléotides
Quelles caractéristiques les amorces NE doivent-elles PAS avoir?
1) Les amorces ne doivent pas être complémentaires (pouvoir s’apparier ensemble)
2) Les amorces ne doivent pas avoir la capacité de former des structures secondaires (hairpin)
3) Les amorces ne doivent pas nécessairement débuter par un nucléotide particulier
