Module 7 - biologie moléculaire

Question 1

Qu’est qu’un plasmide?

Answer 1

Le plasmide est une petite capsule circulaire que l’on retrouve dans les bactéries et qui contient de l’ADN extrachromosomique (3000 à 10 000 paires de bases). On retrouve 1-100 copies de plasmides/bactérie. Le plasmide peut se transmettre de bactérie en bactérie par conjugaison.

Question 2

Quel est le vecteur de clonage utilisé lors du transfert de gène?

Answer 2

Le plasmide

Question 3

Qu’est-ce qu’un ADN/plasmide recombinant?

Answer 3

C’est l’ADN/le plasmide qui a été modifié génétiquement et qui contient désormais le gène d’intérêt.

Question 4

Décrire le principe de clonage dans les vecteurs plasmidiques.

Answer 4

1. Synthèse de la protéine d’intérêt et en isoler le gène d’intérêt
2. Isoler le plasmide d’une bactérie et le couper par des enzymes de restriction aux bons endroits
3. Insérer le gène d’intérêt dans le plasmide coupé pour former l’ADN recombinant
4. Transférer le plasmide recombinant dans une bactérie
5. Mettre les bactéries génétiquement modifiées en culture pour cloner le plasmide. Généralement, on met les bactéries en contact avec un antibiotique auquel les bactéries génétiquement modifiées permettent de résister. La résistance antibiotique permet ainsi d’isoler précisément les cellules ayant incorporé le plasmide, l’antibiotique tuant toutes les bactéries n’ayant pas incorporé le plasmide/n’ayant pas le gène de résistance.

Question 5

Qu’est-ce qu’une endonucléase?

Answer 5

Une enzyme de restriction reconnaissant une séquence spécifique, généralement de 4 à 8 nucléotides, qui représente un motif de palindrome.

Question 6

Qu’est-ce qu’un palindrome?

Answer 6

C’est une séquence de nucléotides dont la séquence complémentaire est une image miroir de la séquence de base. Ex: 5’ GAATTC 3’
3’ CTTAAG 5’

Question 7

Quelle enzyme permet de recréer un site de liaison dans un plasmide?

Answer 7

La ligase est une enzyme qui catalyse la formation du lien phosphodiester.

Question 8

Qu’est-ce que des extrémités cohésives, des extrémités franches?

Answer 8

Extrémités cohésives: les extrémités sont complémentaires, peuvent se recoller

Extrémités franches: ne peuvent pas se recoller, ne sont pas complémentaire

Question 9

L’enzyme de restriction BamH1 reconnaît la séquence GGATCC et coupe après le premier G. Quelle est la séquence de l’extrémité simple-brin protubérante (saillante) dans l’orientation 5’ vers 3’?

Answer 9

GATC:
5’ ….. G 3’ 5’ GATCC …. 3’
3’ ……CCTAG 5’ 3’ ………..G …. 5’

Les nucléotides qui peuvent se coller dans l’orientation 5’ vers 3’ sont GATC.

Question 10

Combien de fragments sont générés pour les molécules linéaires?

Answer 10

Le même nombre que le nombre de sites de coupures + 1

Question 11

Combien de fragments sont générés dans les molécules circulaires?

Answer 11

Le même nombre que le nombre de sites de coupures.

Question 12

Quel composé est responsable de la dénaturation de l’ADN chromosomique?

Answer 12

Le NaOH

Question 13

Comment peut-on renaturer de l’ADN?

Answer 13

En baissant le pH ou en refroidissant lentement.

Question 14

Quel composé assure la dénaturation des phospholipides et des protéines membranaires cellulaires (lyse de la cellule)?

Answer 14

Le SDS

Question 15

Quelle solution permet de précipité le complexe SDS, protéines, lipides et ADN dénaturé?

Answer 15

Une solution de neutralisation composée d’acétate de potassium et d’acide acétique.

Question 16

Qu’est-ce qui permet de séparer l’ADN plasmidique renaturé dans le culot de protéines de l’ADN chromosomique renaturés?

Answer 16

Une centrifugation permettra de recueillir l’ADN plasmidique dans le surnageant et de se débarasser du culot qui contient les autres composés non désirés.

Question 17

Finalement, comment on peut isoler l’ADN plasmidique sous forme de culot?

Answer 17

On transfère le surnageant dans un autre tube. On utilise de l’éthanol pour le précipiter, puis on centrifuge le tout.

Question 18

Qu’est-ce que l’électrophorèse?

Answer 18

C’est un procédé permettant la séparation de molécules chargées sur la base de leur mouvement dans un champ électrique.

Question 19

Quelle est la charge (- ou +) des acides nucléiques à pH égal ou supérieur à 7?

Answer 19

L’ADN est chargé négativement.

Question 20

Quel est le pH du tampon dans un gel d’agarose? Pourquoi?

Answer 20

Le pH est d’environ 8,0 pour permettre à l’ADN d’être chargé négativement.

Question 21

Qu’est-ce que l’agarose?

Answer 21

L’agarose est un polysaccharides linéaire dont l’unité de répétition est un disaccharide. Il est issu des algues rouges, se solubilise à 100°C et est utilisé dans les gels d’électrophorèse.

Question 22

Quel composé est théoriquement utilisé pour coloré les fragments d’ADN et permettre leur visualisation?

Answer 22

Le bromure d’éthidium.

Question 23

Comment est-il possible de générer une photo du gel d’électrophorèse?

Answer 23

En plaçant le gel sous les UV, le complexe ADN-bromure d’éthidium est fluorescent et on peut générer une photo à analyser par la suite.

Question 24

En laboratoire, est-ce qu’on utilise le bromure d’éthidium pour faire la coloration?

Answer 24

Non. Le bromure d’éthidium est mutagène. On utilise plutôt une alternative moins dangereuse, le Redsafe.

Question 25

De quels facteurs dépend la migration des molécules d’ADN dans un gel d’agarose?

Answer 25

Du % d’agarose (concentration du gel), de la force du courant électrique, de la force ionique du tampon d’électrophorèse, de la conformation de l’ADN (linéaire ou circulaire) et de la taille de la molécule.

Question 26

Quelle est la relation entre la concentration d’agarose du gel et la taille des molécules pouvant être séparées?

Answer 26

Moins le gel est concentré en agarose, plus la taille des molécules d’ADN pouvant être séparées est élevée.

Question 27

Quelle est la relation entre la taille (poids moléculaire) des fragments et la distance de migration?

Answer 27

Pour des fragments linéaires, la distance de migration est inversement proportionnelle au log de la taille des fragments.

Question 28

Que signifie une bande de plus grande intensité?

Answer 28

Cela signifie qu’une plus grande quantité (abondance) d’ADN s’y retrouve.

Question 29

À quoi faut-il faire attention lors de la création de la courbe standard.

Answer 29

Il faut prendre en compte uniquement les points faisant partie de la zone de linéarité. Les valeurs aberrantes sont à éliminer, de même que la zone de fin de linéarité.

Question 30

Quelle sera la différence de migration entre des plasmides de même taille, mais de forme différentes (linéaire, circulaire et circulaire superenroulé)?

Answer 30

L’ADN circulaire (plasmidique) migra le moins loin. L’ADN linéaire migrera un peu plus loin. Et l’ADN superenroulé migrera le plus loin.

Question 31

Comment faire pour déterminer la taille d’un plasmide superenroulé?

Answer 31

Il faut utiliser des plasmides superenroulés de tailles connues comme standards.

Question 32

De quelle façon lit-on une séquence d’ADN?

Answer 32

De l’extrémité 5’ phosphate vers l’extrémité 3’ OH

Question 33

Quelles sont les caractéristiques générales de l’ADN double brin?

Answer 33

Les deux brins sont complémentaires (les bases s’associent) et antiparallèles (5’ - 3’ face à face avec 3’ - 5’). Les bases s’associent par des liens H. Les polymères de nucléotides sont liées par des liens phosphodiester.

Question 34

Quelles propriétés sont expliquées par la complémentarité des bases d’ADN?

Answer 34

La dénaturation/renaturation, l’hybridation (appariement des bases) et la polymérisation.

Question 35

Vrai ou Faux? Le génome de la plupart des être vivants est sous forme d’ADN double brin?

Answer 35

Vrai

Question 36

Vrai ou Faux? Le génome est l’ensemble du matériel génétique d’un être vivant donné, qui regroupe les séquences codantes (gènes), mais pas les séquences non codantes?

Answer 36

Faux. Le génome regroupe les séquences codantes ET les séquences non codantes.