Module 11 - Clonage de gènes

Question 1

Qu’est-ce que le génotype?

Answer 1

L’ensemble des gènes qui concertent le développement d’un attribut observé chez un système biologique.

Ex: Aa et aa seraient deux génotypes différents, A étant le gène dominant codant pour les yeux de couleur brune et a étant le gène récessif codant pour les yeux bleus.

Question 2

Qu’est-ce que le phénotype?

Answer 2

Un attribut/trait observable chez un système biologique.

Ex: en suivant l’exemple précédent, le phénotype associé au génotype Aa serait des yeux bruns tandis que le phénotype associé au génotype aa serait des yeux bleus.

Question 3

Donner un exemple de relation génotype-phénotype.

Answer 3

La levure et la plante produisent la leucine (phénotype) et cette production est associée à une série de gènes biosynthétiques dont LEU2 (génotype).

Question 4

Qu’est-ce que l’expression homologue?

Answer 4

Implique l’expression d’un gène (endogène) chez un organisme qui le possède naturellement.

Question 5

Qu’est-ce que l’expression hétérologue?

Answer 5

Implique l’expression d’un gène (exogène) chez un organisme qui NE le possède PAS naturellement.

Question 6

Quels sont les avantages de manipuler la nature pour générer et/ou amplifier des biomolécules d’intéret?

Answer 6

1) Moins coûteux
Ex: la production d’insuline humaine dans les bactéries et éventuellement la production du taxol

2) Plus écologique
3) Plus sain

Question 7

Qu’est-ce qu’une biotechnologie?

Answer 7

C’est toute application technologique utilisant des systèmes biologiques pour fabriquer ou modifier des phénotypes à usage spécifique.

Question 8

Décrire les étapes du clonage moléculaire.

Answer 8

1) Isoler le gène à cloner ou le fragment d’ADN
2) Insérer le fragment/gène d’intérêt dans un vecteur de clonage (ex: plasmide) pour former l’ADN recombinant
3) Transporter/transfecter l’ADN recombinant dans une cellule hôte (ex: bactérie)
4) Cultiver les bactéries génétiquement modifiées
5) Extraire l’ADN recombinant en millions de copies

Question 9

Donner des exemples d’applications du clonage moléculaire.

Answer 9

1) Étudier les fonctions des gènes
2) Reproduire un phénotype intéressant codé par ces gènes
3) Générer un nouveau phénotype synthétique

Question 10

Qu’est-ce que le clonage conventionnel?

Answer 10

C’est le clonage par des enzymes de restriction tel que décrit dans le module 7.

Question 11

Quels sont les avantages du clonage conventionnel?

Answer 11

1) Méthode bien étudiée, très connue et accessible
2) Abordable (pas dispendieuse)
3) On peut ajouter plusieurs sites de restriction sur chaque extrémité pour augmenter les stratégies de clonage, grâce à leur courte longueur

Question 12

Quels sont les inconvénients du clonage conventionnel?

Answer 12

1) Les choix des enzymes de restriction est limité puisque leur site de reconnaissance doivent nécessairement être absents à l’intérieur des inserts et vecteurs
2) Le clonage directionnel ne peut pas se faire avec les enzymes de restriction qui génèrent des bouts francs
3) N’est pas efficace pour le clonage de plus de 2 fragments d’ADN
4) Laisse le site de restriction comme cicatrice après le clonage directionnel

Question 13

En quoi consiste le clonage par la recombinaison Gateway?

Answer 13

La technologie de clonage par recombinaison Invitrogen Gateway permet de contourner les limites de clonage traditionnelles liées aux enzymes de restriction et d’accéder à quasiment n’importe quel système d’expression en quelques étapes. Plusieurs segments d’ADN peuvent être assemblés.

Ce système utilise des séquences recombinantes propriétaires nommées “Gateway att”, ainsi que des enzymes propriétaires nommées “LR Clonase” et “BP Clonase”.

Question 14

Quels sont les avantages du clonage par recombinaison Gateway?

Answer 14

1) Simple et efficace

Question 15

Quels sont les inconvénients du clonage par recombinaison Gateway?

Answer 15

1) Les plasmides ainsi que les enzymes sont dispendieux
2) On ne peut pas revenir au clonage conventionnel une fois le clonage par Gateway terminé (sauf avec une très bonne planification au préalable)
3) Des séquences « cicatrices » peuvent persister dans le produit final

Question 16

En quoi consiste le clonage TOPO (Clonage TA)?

Answer 16

Le clonage TOPO est une technique de biologie moléculaire dans laquelle les fragments d’ADN amplifiés par la polymérase Taq sont clonés dans des vecteurs spécifiques, sans que l’enzyme ADN ligase n’ait besoin de recoller les fragments insérés.

Question 17

Quels sont les avantages du clonage TOPO?

Answer 17

1) Simple et rapide

Question 18

Quels sont les inconvénients du clonage TOPO?

Answer 18

1) L’utilisation de la polymérase Taq a un taux d’erreur de 1 pour chaque 3500 bases
2) L’extrémité 3’-A n’est pas stable, ce qui diminue l’efficacité de la méthode

Question 19

En quoi consiste le clonage Gibson Assembly?

Answer 19

Cette technique de clonage moléculaire permet de joindre plusieurs fragments d’ADN dans une seul vecteur. Cette méthode peut combiner simultanément jusqu’à 15 fragments d’ADN.

Les inserts sont des produits PCR portant des extrémités homologues aux fragments voisins. Les fragments doivent contenir environ 20-40 paires de bases qui se chevauchent avec les fragments voisins/adjacents.

Le vecteur linéarisé est un produit de PCR ou de digestion par des enzymes de restriction dont les bouts sont connus.

La trousse Gibson contient une 5’-exonucléase, une ADN polymérase et une ligase.

Question 20

À quoi sert l’exonucléase 5’?

Answer 20

L’exonucléase ingère l’ADN à partir de l’extrémité 5’, ce qui n’inhibe pas l’activité polymérase et permet à la réaction de se produire en un seul processus.

Question 21

À quoi sert l’ADN polymérase?

Answer 21

L’ADN polymérase ajoute des nucléotides pour remplir les trous.

Question 22

À quoi sert l’ADN ligase?

Answer 22

L’ADN ligase joint de façon covalente l’ADN des fragments adjacents, éliminant ainsi toute coupure dans l’ADN.

Question 23

Résumer les 2 approches Gibson Assembly.

Answer 23

1) Une méthode à une seule étape (Gibson Assembly). Cette technique permet d’assembler jusqu’à 5 fragments différents utilisant un seul processus isothermique. Dans cette méthode, les fragments et le mélange d’enzymes sont combinés et incubés à 50 °C pour 1 heure.
2) Une méthode à 2 étapes (Gibson Ultra Assembly) utilisée pour la création d’une structure plus complexe contenant jusqu’à 15 fragments ou ayant un taille entre 100 pb et 10 kb. Cette technique nécessite l’ajout en deux temps de 2 mélanges : l’un pour l’exonucléase 3’ et le vecteur linéarisé et l’autre pour l’ADN polymérase et la ligase. Différentes températures d’incubation sont utilisées pour l’assemblage.

Question 24

Quels sont les avantages du clonage Gibson?

Answer 24

1) Rapide et peu dispendieux (requiert moins d’étapes et de réactifs)
2) Pas de cicatrices dans les sites de restriction entre 2 fragments d’ADN
3) Jusqu’à 5 fragments peuvent être assemblés simultanément en une seule étape et jusqu’à 15 en 2 étapes
4) Peut être utilisé pour la mutagenèse dirigée afin d’incorporer des mutations spécifiques dans l’ADN

Question 25

En quoi consiste le clonage par des enzymes de restriction type IIS (Golden Gate)?

Answer 25

Cette technique de clonage moléculaire permet de joindre plusieurs fragments d’ADN simultanément dans une seul vecteur.

Les inserts sont des produits PCR portant des extrémités homologues aux fragments voisins + un site de reconnaissance d’une endonucléase Type IIS.

Le vecteur linéarisé est un produit de de digestion par une enzyme de restriction Type IIS.

La trousse Golden Gate contient une endonucléase Type IIS et une ligase.

Question 26

Résumer l’approche Golden Gate.

Answer 26

Étape 1: les endonucléases s’associent à leurs sites de reconnaissance sur les fragments coupés et le vecteur linéarisé, ce qui permet de créer des extrémités cohésives.

Étape 2: La ligase colle les extrémités ensemble pour former le produit final.

Un thermocycleur typique oscille entre différentes températures ( 37 °C pour les enzymes de restriction et 16 °C pour la ligase).

Question 27

Quels sont les avantages du clonage Golden Gate?

Answer 27

1) Contrairement aux enzymes de restriction de Type II standards (EcoRI et BamHI), les enzyme de type IIS coupent l’ADN à l’extérieur des sites de reconnaissance. Elles peuvent ainsi créer des séquences non-palindromiques. En pratique, cela signifie que le clonage Golden Gate ne créé pas de cicatrices.
2) Puisque le produit final n’a pas un site de reconnaissance de type IIS, le produit ne peut pas être coupé encore par une enzyme de restriction, donc la réaction est irréversible.