Module 10 - Électrophorèse de protéines

Question 1

Pour quels composés est utilisé le gel de polyacrylamide?

Answer 1

Pour les acides nucléiques de petite taille et les protéines.

Question 2

Vrai ou Faux. Le gel de polyacrylamide est chargé positivement.

Answer 2

Faux. Le gel est non chargé et inerte.

Question 3

Comment peut-on former un gel poreux qui pourra être utilisé lors de l’électrophorèse?

Answer 3

En faisant la polymérisation de l’acrylamide seul avec le bis-acrylamide, un agent réticulant.

Question 4

Quelle est la relation entre le % d’acrylamide dans le gel et la distance de migration d’une protéine?

Answer 4

Plus le % d’acrylamide est élevé, moins la protéine migre loin. Un % d’acrylamide élevé forme plus de pores, donc nuit davantage à la migration des protéines.

Question 5

De quoi dépend la taille des pores dans un gel de polyacrylamide?

Answer 5

1) Du % total d’acrylamide et de bis-acrylamide

2) De la proportion acrylamide/bis-acrylamide

Question 6

Quelle modification pourrait-on faire dans un protocole pour qu’une protéine migre davantage dans le gel/soit plus au centre?

Answer 6

Diminuer la concentration de polyacrylamide du gel

Question 7

Quel composé est nécessaire pour initier la polymérisation de l’acrylamide?

Answer 7

Le persulfate d’ammonium, lequel fournit des radicaux libres au mélange d’acrylamide qui sont nécessaires à la polymérisation…

Question 8

Quel composé est rajouté au mélange d’acrylamide pour accélérer la réaction de polymérisation?

Answer 8

Le TEMED

Question 9

Quel réactif inhibe la réaction de polymérisation d’un gel de polyacrylamide?

Answer 9

L’oxygène

Question 10

Qu’est-ce que l’électrophorèse en conditions natives?

Answer 10

C’est l’électrophorèse en conditions non-dénaturantes, donc les protéines conservent leur structure 3D.

Question 11

De quoi dépend la séparation des protéines lors de l’électrophorèse en conditions natives?

Answer 11

1) Charge nette
2) Structure (forme)
3) Taille (poids moléculaire)

Question 12

Pour quels types d’étude serait-il préférable de faire l’électrophorèse en conditions natives?

Answer 12

Pour des études où la structure de la protéine doit être conservée, donc des études structurales, fonctionnelles ou enzymatiques.

Question 13

Lorsque le pH est inférieur au pI d’une protéine, quelle est la charge de cette protéine (+ ou -)?

Answer 13

Positive (+)

Question 14

Lorsque le pH est supérieur au pI d’une protéine, quelle est la charge de cette protéine (+ ou -)?

Answer 14

Négative (-)

Question 15

Comment pourrait-on déterminer le pI d’une protéine. Quel type d’électrophorèse devrait être utilisé?

Answer 15

On utilise l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions non-dénaturantes pour séparer les protéines selon leur charge.

Le gel de polyacrylamide utilisé pour ce type d’électrophorèse contient un gradient de pH (une extrémité du gel est basique tandis que l’autre est acide). Le pH diminue graduellement le long du gel.

À pH très basique, les protéines portent toutes des charges nettes négatives; elles migrent donc vers l’électrode positive. À mesure qu’elles migrent dans le gel, il y a modification de leur charge nette, car le pH du gel change. Lorsqu’une protéine se retrouve dans une zone correspondant à son pI, elle ne porte plus de charge nette. Par conséquent, elle n’est plus entraînée par le champ électrique et il y a arrêt de sa migration.

Question 16

Qu’est-ce que l’électrophorèse en conditions dénaturantes?

Answer 16

C’est l’électrophorèse avec l’ajout d’un détergent anionique, le SDS.

Question 17

Quelles sont les propriétés du SDS?

Answer 17

Le SDS est un détergent qui:

1) Brise les interactions non covalentes (ex: liens H) dans les protéines (dénature les protéines)
2) Uniformise la forme et la densité de charge des protéines

Question 18

De quoi dépend la séparation des protéines lors de l’électrophorèse SDS-PAGE (conditions dénaturantes)?

Answer 18

De la masse moléculaire uniquement!!!

Les molécules de SDS sont chargées négativement. Le nombre de molécules de SDS qui se lient à une protéine est proportionnel à la taille de celle-ci. La méthode SDS-PAGE permet donc d’uniformiser le ratio charge/masse des protéines et de les séparer selon leur masse moléculaire uniquement.

Question 19

Quels sont les paramètres que l’on peut déterminer avec l’électrophorèse SDS-PAGE?

Answer 19

1) La masse moléculaire apparente des protéines
2) Le nombre de sous-unités d’une protéine
3) La pureté d’un échantillon suite à un procédé de purification

Question 20

Quelle est la différence entre la dégradation et la dénaturation d’une protéine?

Answer 20

Dégradation: perte de la structure primaire par des protéases, irréversible

Dénaturation: perte des structures tertiaire et quaternaire par des changements de température, de pH ou l’ajout de détergents (SDS), réversible

Question 21

Quel est le rôle du β-mercaptoéthanol dans l’électrophorèse SDS-PAGE?

Answer 21

Le β-mercaptoéthanol est un agent réducteur qui détruit les ponts disulfures formés entre les résidus Cys en présence de chaleur.

Question 22

Pourquoi a-t-on besoin de compléter la dénaturation des protéines avec de la chaleur et un pH acide?

Answer 22

Pour être certain que la dénaturation est complète et pour déplier et linéariser les molécules.

Question 23

En quoi consiste le SDS-PAGE en système discontinu?

Answer 23

En la séparation de deux gels de polyacrylamide:

1) Gel de concentration/d’empilement (2-4%)
2) Gel de résolution/séparation (7-15%)

On utilise deux tampons de pH différents, ce qui permet de concentrer les échantillons en une fine bande pour une meilleure résolution.

Question 24

De quoi est habituellement composé le gel d’empilement et quel est son pH?

Answer 24

De tampon TRIS-HCl à pH 6,8.

Question 25

De quoi est habituellement composé le gel de séparation et quel est son pH?

Answer 25

De tampon TRIS-HCl à pH 8,8.

Question 26

Quel est le mouvement des différentes molécules et ions dans le gel d’empilement?

Answer 26

1) À pH 6,8, la glycine est sous sa forme zwitterion (neutre), donc elle migre très lentement.
2) Les protéines, chargés négativement par le SDS en absence d’électrolytes, migrent un peu plus vite que la glycine, étant attirés par le pôle positif.
3) Les ions Cl-, chargés négativement, migrent le plus rapidement, étant petits et voulant s’éloigner du pôle négatif.

Question 27

Quel est le mouvement des différentes molécules et ions à la séparation gel d’empilement/gel de séparation?

Answer 27

1) Au contact du gel de séparation (pH 8,8), les ions glycine deviennent chargées négativement.
2) Les protéines sont rattrapées par le front des glycines. Toute les protéines forment désormais une mince bande.
3) Les ions Cl- continuent leur migration rapide.

Question 28

Quel est le mouvement des différentes molécules et ions dans le gel de séparation?

Answer 28

1) Les protéines sont dépassées par les ions glycines, ces ions étant plus petits et désormais complètement chargés négativement.
2) Les ions chlorure continuent d’être les plus rapides puisqu’ils sont très petits.

Question 29

Quel composé est utilisé pour colorer les protéines afin de permettre leur visualisation?

Answer 29

Le bleu de Coomassie

Question 30

Comment déterminer la taille (poids moléculaire) de protéines inconnues?

Answer 30

En faisant la courbe standard du log de la masse moléculaire des protéines du marqueur de taille en fonction de la distance de migration.

*Attention, il faut que la courbe standard soit la plus linéaire possible et on pourrait avoir à éliminer des valeurs aberrantes pour y parvenir…

Question 31

En quoi consiste l’électrophorèse à deux dimensions (2D)?

Answer 31

1) Électrophorèse par isofocalisation (1re dimension)

2) Électrophorèse SDS-PAGE (2e dimension)

Question 32

Vrai ou Faux. La première dimension de l’électrophorèse 2D se fait en conditions natives.

Answer 32

Vrai.

La première dimension est l’isofocalisation, c’est-à-dire qu’on sépare les protéines selon leur pI en créant un gradient de pH en utilisant une série d’ampholytes.

Chaque protéine cesse de migrer lorsque le pH = pI.

Question 33

Vrai ou Faux. La deuxième dimension de l’électrophorèse 2D se fait en conditions dénaturantes.

Answer 33

Vrai. La deuxième dimension consiste à placer horizontalement le gel sur le dessus d’un gel de type SDS-PAGE. Au cours de cette seconde migration, les protéines sont séparées selon leur masse moléculaire.