Module 4- La structure primaire des protéines

Question 1

À partir de combien de résidus considère-t-on que l’on est en présence d’un polymère? Et d’une protéine?

Answer 1

À partir de 20 résidus pour le polymère et 50 pour la protéine

Question 2

Quelle est le nombre de résidus de la majorité des protéines?

Answer 2

Entre 100 et 1000

Question 3

À partir de combien de résidus obtient-on une structure 3D stable qui permet une fonction intéressante?

Answer 3

40

Question 4

Qu’est-ce qu’un peptide monomérique?

Answer 4

Constituée d’une seule chaîne polypeptidique (polypeptide = s’applique aux protéines et polypeptides)

Question 5

Qu’est-ce qu’une protéine multimérique et oligomérique? Et qu’est-ce qu’une sous-unité?

Answer 5

Une protéine multimérique ou oligomérique est une protéine constituée de plusieurs sous-unités (chaîne de polypeptides).

Question 6

Que veut dire homomultimère et hétéromultimère?

Answer 6

Homomultimère= répétition d’une seule et même sous-unité
et hétéromultimère= formée d’au moins deux sous-unités différentes

Question 7

Qu’est-ce qui détermine la séquence de polymérisation des acides aminés d’une protéine?

Answer 7

C’est l’ordre spécifié par les gènes

Question 8

Comment ce nomme la séquence linéaire d’acides aminés d’une chaîne peptidique?

Answer 8

Structure primaire

Question 9

Comment ce fait l’union entre deux acides aminés?

Answer 9

Entre le alpha-carboxyle et le alpha-amine d’un autre acide aminé pour former un lien amide (aussi nommé lien ou liaison peptidique)

Question 10

Dans une protéine, où se situe le alpha-carboxyl et le alpha-amine?

Answer 10

le carboxyle - extrémitée C-terminale

le amine - extrémité N-terminale

Question 11

Combien de liens comporte une protéine de n acides aminés?

Answer 11

n-1

Question 12

Quesqu’y fait différer légèrement les valeurs de pKa des acides aminés losqu’ils se retrouvent dans un polypeptide?

Answer 12

L’intérieur d’un polypeptide constitue un microenvironnement duquel les molécules d’eau sont exclues.

Question 13

Comment alors que le pka des acides aminés est différent dans un polypeptide pouvons-nous déterminer la charge de celui?

Answer 13

On peut utiliser une approximation de la charge d’un court peptide avec le pKa des acides aminés qui le compose

Question 14

Comment détermine -ton le pI des protéines?

Answer 14

Par expérimentation

Question 15

Comment détermine t-on la séquence d’un peptide?

Answer 15

On commence par l’extrémité N-terminale jusqu’à C-terminale. On utilise le noms des acides aminés se terminant par -yl sauf pour le C-terminal qui aurra sont nom commun. Mais on utilise surtout le code à une lettre.

Question 16

Plusieurs peptides ont une activité biologique importante. Nommez celles de ces peptides:

Glutathion (GSH)
Glucagon, ocytocine et vasopressine
endorphine et la susbtance P
Aspartame
Venin de serpent et de champignon

Answer 16

Glutathion (GSH) = molécule antioxydante majeure des cellules
Glucagon, ocytocine et vasopressine = peptides hormonaux servant de messagers chimiques
endorphine et la susbtance P = neuropeptide servant de neurotransmetteurs et neuromodulateurs
Aspartame = dipeptide synthétique servant d’édulcorant
​Venin de serpent et de champignon = toxine (défense)

Question 17

Les molécules d’une protéines en particulier peuvent représenter souvent moins de _____% du poids sec de la cellule

Answer 17

1%

Question 18

Quelles propriétés physico-chimiques peuvent être utilisées lors de la purification d’une protéine?

Answer 18

solubilité, taille, charge, affinité.

Question 19

Comment véréfie t-on la pureté d’un échantillon d’une protéine?

Answer 19

Par le pI et la masse moléculaire

Question 20

Quelle est la masse molaire moyenne d’un acide aminé? et celle d’une protéine?

Answer 20

AA = 110 Da

Protéine = 10 000 à 10⁶ Da

Question 21

Quelle est la différence entre la séquence et la composition d’une protéine?

Answer 21

Séquence = ordre dans lequel les acides aminées ce trouvent (en commençant par N-terminale)

Composition = quels acides aminés le composent

Question 22

Nommez les 8 principales étapes du séquençage des protéines?

Answer 22

1- Bris des ponts disulfures

2-Bris des interactions non covalentes

3- Composition en acides aminés

4- Caractérisation des deux extrémités

5- Fragmentation des chaînes polypeptidiques

6- Séquençage des fragments
a)répéter étape 5 et 6 avec une seconde méthode de fragmentation

7-Reconstruire la séquence

8-Localisation des ponts disulfures

Question 23

Comment est-il beaucoup plus facile de séquencer indirectement les protéines?

Answer 23

En séquençant l’ADN qui contient toute l’Information de la synthèse des protéines. On utilise alors des logiciels spécialisés.

Question 24

Quesqu’y est possible d’obtenir sans purifier ou manipuler la protéine? (3)

Answer 24

Sa structure primaire, sa masse moléculaire, son pI

Question 25

Quesque les analyzes de comparaison de l’ADN in silico (par ordinateur) ne peuvent prédire sur les protéines?

Answer 25

les modifications post-traductionnelles et si la protéines est composée d’une ou de plusieurs sous-unités

Question 26

Que pouvons-nous déduire de deux protéines de deux organismes différents ayant la même fonction?

Answer 26

Qu’ils ont probablement des séquences similaires

Question 27

Que veut dire une protéine homologue, orthologue et paralogue?

Answer 27

homologue= degrés significatif de similarité de séquence (dérivé d'un ancêtre commun, peuvent être orthologue ou paralogue)
orthologue = deux protéines homologues ayant la même fonction de deux organismes différents
paralogue =  protéines homologues dans un même organisme et ayant des rôles différents

Question 28

Quelle est l’utilité de la comparaison entre les protéines orthologues sur l’importance de certains acides aminés dans les protéines? Et ​la substitution conservatrice?

Answer 28

Lorsqu’un résidu montre une grande variabilité entre les espèce, il n’a pas une grande importance et le contraire est vrai.
La substitution conservatrice est lorsqu’un résidu est substitué par un autre aux caractéristiques semblables

Question 29

Quesqu’un arbre phylogénétique et à quoi servent-ils?

Answer 29

C’est un schéma réaliser selon le pourcentage de similarité entre protéines orthologues de plusieurs espèces. Ils permettent d’illustrer la distance évolutive entre les organismes.

Question 30

Quelle est la première étape lorsque l’on veut extraire une protéine et quels sont les deux étapes la constutuant? décrivez brievement le pourquoi de ces étapes.

Answer 30

On doit d’abors préparer l’extrait de protéine

1. libération du contenu cellulaire : On brise alors les membarnes pour libérer le contenu untracellulaire.
2. Centrifugation différentielle : on fait des centrifugation à différentes vitesses et temps pour éliminer les particules non désirées tels que les résidus de membranes et oorganites

Question 31

La solubilité d’une protéine dépend de quoi? et de quoi dépend ces deux facteurs?

Answer 31

La charge et la polarité qui eux dépendent du pH et de la force ionique

Question 32

Comment arrive t-on à purifier une protéine selon sa solubilité seulement en modifiant le pH?

Answer 32

La protéine est à sa solubilité minimal lorsque son pI=pH ainsi sous sa forme zwitterion. Ainsi lorsque le pI = pH on peut rendre la protéine insoluble et la faire précipité.

Question 33

Que signifie Salting in et Salting out?

Answer 33

Lorsque la concentration en sels est faible, on parle de salting in, là où les ions favorisent la solubilité de la protéine (faible force ionique). Salting out est lors d’une concentration de sels élevées où les ions accaparent l’eau et diminuent la solubilité de la protéine (forte force ionique)

Question 34

Comment la purification selon la solubbilité fonctionne?

Answer 34

On peut atteindre la solubilité minimale si le pH=pI et lors d’une forte présence de sels. On peut cibler la protéine voulu et la faire précipité ou la rendre surnageante. On centrifuge ensuite l’échantillon pour séparer la protéine voulue.

Lorsque la protéine cible est le précipité, cette étape sert aussi à concentrer la protéine. On se débarasse alors délicatement du surnageant et de solubiliser la protéine dans un plus petit volume de tampon.

Mais cette méthode demande de réduire ensuite la concentration en sels qui peut nuire aux prochaines étapes (par dialyse ou chromatographie d’exclusion)

Question 35

La purification selon le principe de chromatographie, utilise une burette contenant une phase stationnaire et mobile. Décrivez les brievement.

Answer 35

Phase stationnaire (bas colone): susbtance insoluble contenue dans la colone et interagissant avec la protéine et varie selon la propriété utilisée pour la purification.

Phase mobile(haut colone): échantillon contenant la protéine cible

Question 36

Décrivez le principe de base de la chromatographie?

Answer 36

Après avoir placé la phase stationnaire puis mobile, on ajoute continuellement du solvant pour entrainer les différents composé de l’échantillon vers le base de la colonne. Les différentes protéines seront entraînées à des vitesses variables. Plus une protéine interagira avec la phase stationnaire plus ce serra long avant dillution. On récupère au bas de la colonne selon une séquence et chaque tubes serra analysés par spectroscopie pour détecter celles contenant ces molécules.

Question 37

Comment fonctionne la filtration sur gel ou chromatographie par tamisage moléculaire ou chromatographie sur gel ou encore chromatographie d’exclusion sphérique et elle purifie selon quelle paramètre de la protéine?

Answer 37

Elle purifie selon la taille

Elle est comme la chromatographie de base mais la phase stationnaire est constitué de bille (ayant des grosseurs de pores contrôlés) ralentissant les protéines selon leur taille. MAIS ATTENTION, LES GROSSES MOLÉCULES MIGRENT LE PLUS VITE car elles ne peuvent entrer entre les pores des molécules et migrent alors rapidement.

Question 38

Mise à par purifier, à quoi peut aussi servir la chromatographie d’exclusion?

Answer 38

On peut estimer sa masse moléculaire par comparaison avec des masses moléculaires connues de protéines qu’on y rajoutent.

(MAIS QU’UNE APPROXIMATION)

Question 39

Comment fonctionne la chromatographie selon la charge?

Answer 39

La phase stationnaire est est composées de billes inertes et insolubles sur lesquels sont fixés des groupements anionique (résine chargée + liant les anions) ou cationique (résine chargée - liant les cations). On envoit notre échantillon qui serra suivit d’un solvant salin où les Na+ entreront en compétition et feront décrocher de manière graduelle les protéines en commençant par ceux ayant de moins forts liens.

Question 40

Comment fonctionne la chromatographie d’affinité?

Answer 40

Ici, la phase stationnaire est composé de polymères lié de façon covalente à un ligant ciblant une protéine X (ex: coenzyme, susbtrat, anticorps, etc) Lorsqu’un mélange de protéines circule à travers la colonne, seule celle qui a une affinité importante
pour le ligand est retenue. Les autres protéines migrent avec le flux de solvant. On peut par la suite
éluer la protéine cible de deux façons : en changeant le pH du flux de solvant, ce qui brise les
interactions faibles entre le ligand et la protéine, ou en ajoutant une solution contenant une forte
concentration de ligand. Les liaisons faibles qui retiennent le ligand à la protéine se brisent et se
reforment constamment. Lorsque la concentration du ligand libre est beaucoup plus élevée que celle
du ligand fixé à la résine, les protéines ont plus de chances de reformer les liaisons avec les
molécules de ligand libre, ce qui les libère de la colonne. Elles seront donc récupérées avec le flux de
la solution de ligand libre.

Question 41

Quesque le HPLC?

Answer 41

la chromatographie liquide à haute performance, communément
appelée HPLC. C’est en quelque sorte une version robotisée de la chromatographie. Le flux de
solvant est contrôlé par un ordinateur et la colonne est pressurisée. De plus, la colonne est
habituellement reliée à un détecteur, par exemple un spectrophotomètre, et à un collecteur de
fractions.
Un appareil de HPLC peut servir à presque tous les types de chromatographie sur colonne, il suffit
d’utiliser une colonne qui contient la résine appropriée

Question 42

Quels sont les types d’analyses pour caractériser une protéine? (4)

Answer 42

Détection et dosage

vérification de la pureté

détermination de la masse moléculaire

détermination du pI

Question 43

Comment peut-on déterminer que notre échantillon contient des acides aminés aromatiques?

Answer 43

Ces acides aminés absorbent les UV. Alors on utilise la spectrophotométrie. (La tyrosine et le tryptophane ont un
maximum d’absorption de la lumière à une longueur d’onde d’environ 280 nm, tandis que la phénylalanine a une absorption maximale à une longueur d’onde 260 nm. )

Question 44

Dans le principe de spectrophométrie, quel principe est fondamental? En fait quel est le lien entre l’absorbance et la concentration de la solution?

Answer 44

l’absorbance d’une solution contenant un soluté X est directement
proportionnelle à sa concentration.

Question 45

Lorsque la solution à analyser est pure et que le coefficient
d’extinction molaire du soluté est connu, on peut déterminer de manière précise la concentration de la solution grâce à la loi de Beer-Lambert, mais que faire lorsque ce n’est pas le cas?

Answer 45

Dans le cas de mélanges de protéines ou d’une protéine dont le coefficient d’extinction molaire n’est
pas connu, il faut avoir recours à des méthodes colorimétriques. Ainsi, les protéines seront traitées
avec des réactifs de manière à ce qu’elles absorbent la lumière visible. Plusieurs méthodes de dosage
de protéines sont basées sur la coloration. Pour déterminer la concentration dans les échantillons
colorés, une courbe standard ou courbe étalon devra être construite. (densité optique en fonction de la concentration)

Question 46

Quesque l’éléctrophorèse?

Answer 46

On regroupe sous le terme électrophorèse les méthodes permettant de séparer les composantes d’un
mélange en fonction de leur vitesse de migration dans un gel en présence d’un champ électrique. Lors
de l’électrophorèse, les molécules chargées migrent vers l’électrode de charge opposée. Trois facteurs
influencent la migration d’une molécule dans un gel : sa charge, bien sûr, mais également sa forme et
sa masse moléculaire.
Les molécules doivent passer au travers du réseau de pores présent dans le gel. Contrairement à la
chromatographie d’exclusion, les plus grosses molécules ne sont pas exclues. Par conséquent, pour
une même charge, les petites molécules migrent plus rapidement que celles de grande taille, car elles
se faufilent plus facilement dans le réseau du gel. Les grosses molécules rencontrent plus de
résistance. Une fois la migration terminée, le gel est traité avec un colorant afin de visualiser les
différentes composantes.

Question 47

Quels sont les différentes techniques d’électrophorèses? (3) et pouvons-nous l’utiliser aussi pour la purification?

Answer 47

PAGE =électrophorèse sur gel d’acrylamide en conditions natives

SDS-PAGE = même chose mais en conditions dénaturantes

IEF (IsoElectric Focusing) = focalisation isoélectrique

OUI

Question 48

Pour quoi est utilisé l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide avec ou sans SDS?

Answer 48

pour vérifier la pureté
d’une solution protéique

Question 49

Quel est la différence première entre PAGE, SDS-PAGE et IEF?

Answer 49

Le PAGE en absence de SDS ne permet pas de déterminer la masse moléculaire ou le pI d’une
protéine. Le SDS-PAGE et la focalisation isoélectrique ont été développés afin de permettre ce type
d’analyses.

Question 50

Quesque le SDS-PAGE?

Answer 50

c’est l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes. Les échantillons protéiques sont préalablement traités avec du SDS et un agent réducteur afin de
dénaturer la protéine, c’est-à-dire afin de détruire sa structure tridimensionnelle (sa forme). Le SDS, qui est un détergent, permet le bris des interactions non covalentes, tandis que l’agent réducteur, souvent le β-mercaptoéthanol,
détruit les ponts disulfures. Le tampon utilisé pour préparer le gel contient également du SDS; la
présence de ce détergent permet de s’assurer que les protéines demeureront dénaturées durant
l’électrophorèse.
Le SDS a une seconde fonction dans ce type d’électrophorèse. Les molécules de SDS sont chargées
négativement. Le nombre de molécules de SDS qui se lient à une protéine est proportionnel à la taille
de celle-ci. Par conséquent, les protéines mises en présence de SDS ont une densité de charge
négative uniforme.
La méthode SDS-PAGE permet donc de séparer les protéines selon leur masse moléculaire
uniquement.

Question 51

Comment détermie t-on la masse moléculaire par SDS-PAGE

Answer 51

Lors d’un SDS-PAGE, il faut déposer dans un premier puits un mélange de protéines de masses
moléculaires connues, appelées marqueurs. L’échantillon contenant la protéine de taille inconnue est
ensuite déposé dans le second puits. Après migration, le gel est coloré. Puis, les distances parcourues
par la protéine inconnue et les marqueurs de masse moléculaire sont mesurées. Une courbe standard
exprimant le log de la masse moléculaire en fonction de la distance nous permet ensuite d’estimer la
masse moléculaire de la protéine inconnue.

Question 52

Comment le SDS-PAGE nous donne des indices sur la structure 3D?

Answer 52

En plus de nous renseigner sur la pureté et la masse moléculaire d’une protéine, le SDS-PAGE peut
nous donner des indices sur sa structure 3D. En effet, on peut détecter la présence de ponts disulfures
en comparant des échantillons de la protéine avant et après traitement avec un agent réducteur.
On peut également déterminer le nombre de chaînes polypeptidiques formant la protéine en
comparant les masses moléculaires estimées par chromatographie d’exclusion avec celles obtenues
sur SDS-PAGE avec des échantillons traités et non-traités au b-mercaptoéthanol.

Question 53

Quesque la focalisation isoélectrique permet de déterminer? et comment?

Answer 53

Le pI d’un peptide ou d’une protéine.Le gel de polyacrylamide utilisé pour ce type d’électrophorèse contient un gradient de pH; c’est-à-
dire qu’une extrémité du gel est basique, tandis que l’autre est acide. Le pH diminue graduellement le
long du gel.
À pH très basique, les protéines portent toutes des charges nettes négatives; elles migrent donc vers
l’électrode positive. À mesure qu’elles migrent dans le gel, il y a modification de leur charge nette,
car le pH du gel change. Lorsqu’une protéine se situe dans la zone du gel correspondant à son point
isoélectrique, elle ne porte plus de charge nette. Par conséquent, elle n’est plus entraînée par le
champ électrique et il y a arrêt de sa migration.

Question 54

Quesque l’électrophorèse 2D?

Answer 54

Il s’agit de faire une première migration dans un gel contenant un
gradient de pH, ce qui permet de séparer les protéines selon leur pI. Ce gel est ensuite placé
horizontalement sur le dessus d’un gel de type SDS-PAGE. Au cours de cette seconde migration, les
protéines sont séparées selon leur masse moléculaire.

Question 55

Quesque la protéomique?

Answer 55

La protéomique est l’étude du protéome, c’est-à-dire de
l’ensemble des protéines d’un organisme.

Question 56

Quesque la spectrométrie de masse? et quelles sont les deux sortes?

Answer 56

La spectrométrie de masse
est utilisée pour déterminer la masse moléculaire et la structure primaire des peptides. Dans ce type
d’analyse, on mesure le temps que prend une molécule chargée en phase gazeuse pour voyager dans
un tube.
D’abord, il faut savoir que les peptides ne peuvent pas être vaporisés par chauffage, car la chaleur les
détruit. Deux techniques permettent d’amener les peptides en phase gazeuse : l’ionisation par
électrodispersion, plus connue sous le terme ESI, et de la désorption au laser favorisée par la matrice,
appelée aussi MALDI. L’ESI utilise un voltage élevé afin de vaporiser les peptides. Pour le MALDI,
les peptides sont associés à une matrice qui est excitée par un laser. L’excitation de la matrice
entraîne la vaporisation des peptides. Une fois les peptides vaporisés, ils doivent passer dans un champ électrique, puis traverser un tube,
avant d’atteindre le détecteur. Le temps que prend un peptide pour parcourir ce tube, ce qu’on
appelle le temps de vol, dépend du rapport de sa masse sur sa charge (noté m/z).
Les masses moléculaires des peptides sont déterminées à l’aide de logiciels de bio-informatique
spécialisés

LA MÉTHODE LA PLUS PRÉCISE!!! 1 pmol peut suffire!!

Question 57

Quelle est la méthode la plus précise pour déterminer la masse moléculaire?

Answer 57

La méthode de spectrométrie de masse

Question 58

La masse moléculaire peut être
estimée par 3 méthodes.Donnez les en ordre de précision.

Answer 58

la chromatographie d’exclusion, le SDS-PAGE et la spectroscopie de masse

Question 59

Comment briser les ponts disilfures?

Answer 59

La 1re étape consiste à briser les ponts disulfures entre les résidus cystéine à l’aide d’un agent réducteur tel que le
β-mercaptoéthanol. Cependant, rien n’empêche les ponts disulfures de se reformer par la suite. Il faut donc également traiter la protéine avec un agent d’alkylation, tel que
l’iodoacétate, qui bloque les groupements –SH

Question 60

Quelles sont les 3 méthodes pour le bris des interactions non covalentes?

Answer 60

la chaleur, un détergent (SDS), ou un agent chaotropique (urée)

Question 61

Le bris des interactions non covalentes doit être suivie d’une méthode pour purifier chaque chaîne. Quelle est cette méthode?

Answer 61

Par HPLC ou électrophorèse

Question 62

Pour déterminer la composition d’une chaîne polypeptidique, il faut d’abord briser tous les liens
___________ et ensuite analyser les résidus libérés.
L’hydrolyse des liens peptidiques se fait dans des conditions __________, à pH très _________ et à une
température ________.

Answer 62

peptidique, extrêmes,acide,très élevée

Question 63

Quel produit utilise t-on pour traiter les produit de l’hydrolyse des liens peptidiques? et où se lie t-il?

Answer 63

On utilise le réactif d’Edman, soit le phénylisothiocyanate ou PITC, pour traiter les produits de
l’hydrolyse. En milieu basique, le PITC se lie au groupement α-amine de chaque acide aminé. Les
acides aminés ainsi marqués sont appelés PTC-acides aminés. Les PTC-acides aminés portent un
cycle aromatique, ce qui les rend détectables par spectrophotométrie UV (254 nm).

Question 64

Toujours dans l’étape 3, composition de la protéine, après avoir hydrolyser les liens peptidiques et formé de PTC-acides aminés, que fait-on?

Answer 64

On est a l’étape d’analyse qui serra fait par HPLC. Le temps que prend un PTC-acide aminé
donné pour être élué est comparé avec les temps d’élution des 20 acides aminés standards marqués
au PITC.
Certains acides aminés sont partiellement détruits dans les conditions extrêmes de l’hydrolyse acide.
C’est le cas des acides aminés asparagine et glutamine pour lesquels l’hydrolyse détruit les
groupements amides. Il est donc impossible de distinguer un aspartate d’une asparagine et un
glutamate d’une glutamine. On utilise des codes à 1 et 3 lettres particuliers pour indiquer cette
ambiguïté.
Il faut noter que l’échantillon utilisé lors de cette étape ne peut plus servir pour les étapes
subséquentes.

Question 65

Comment caractérisons-nous les extrémités N-terminale et C-terminale?

Answer 65

L’analyse de l’extrémité N-terminale utilise également le PITC. On marque tout d’abord les chaînes
obtenues à l’étape 2. Comme une chaîne polypeptidique n’a qu’une seule fonction α-amine libre, il y
aura ajout d’une seule molécule de PITC. On traite ensuite le PTC-peptide avec de l’acide trifluoroacétique, ce qui libère le résidu en N-terminale. Finalement, le PTC-acide aminé relargué est analysé par HPLC comme à l’étape 3

Pour ce qui est de l’extrémité C-terminale, on libère le résidu à cette extrémité en utilisant une
carboxypeptidase. Une fois libéré, ce résidu est traité avec le réactif d’Edman. Ensuite, il est identifié
par HPLC.
Encore une fois, il faut noter que l’échantillon utilisé lors de cette étape ne peut plus servir pour les
étapes subséquentes

Question 66

Comment s’effectue l’étape 5, soit la fragmentation des chaînes?

Answer 66

On doit par la suite couper chacune des chaînes polypeptidiques obtenues à l’étape 2 afin d’obtenir
une série de fragments contenant entre 30 et 40 résidus. Pour ce faire, on utilise des méthodes
enzymatiques ou chimiques.
Les endopeptidases coupent les liens peptidiques à l’intérieur de la chaîne. La trypsine et la
chymotrypsine en sont deux exemples. Chacune reconnaît des acides aminés spécifiques et coupe le
lien peptidique avec le résidu suivant si celui-ci n’est pas une proline. En effet, les protéases sont
souvent sensibles à la présence d’une proline. Cela est dû à la structure particulière du groupement
amine de la proline. Je vous rappelle que la proline est le seul acide aminé standard à avoir un
groupement amine secondaire. Les méthodes chimiques ont des modes d’action plus variés.

* voir tableau pour plus de précision

Question 67

Quelles sont les deux méthodes pour le séquençage des fragments?

Answer 67

Dégradation d’Edman (on doit séparer les fragments avant l’analyse)

Spectroscopie de masse (ne necessite pas de séparation et de plus en plus utilisée)

Question 68

Comment se fait le séquençage des fragments par la méthode d’Edman?

Answer 68

La dégradation d’Edman est en fait une succession d’analyses du résidu en N-terminal. À la fin de
chaque analyse, on récupère le peptide raccourci d’un résidu et on l’utilise pour une nouvelle
réaction au PITC. Comme il y a perte de molécules lors de la récupération du peptide n-1, cette
méthode est moins efficace avec les longs peptides. La taille moyenne des peptides analysés par cette
méthode est de 30 à 40 résidus.

Question 69

pourquoi les étapes 5 et 6 doivent être répétées avec une deuxième méthode de
fragmentation?

Answer 69

Pour reconstruire la séquence complète, les séquences de 2 séries distinctes de fragments sont
nécessaires. C’est pourquoi les étapes 5 et 6 doivent être répétées avec une deuxième méthode de
fragmentation.
Les chevauchements entre les 2 séries de fragments permettent de déterminer l’ordre des fragments
dans la séquence primaire finale

Question 70

Faite un résumé de toute la méthoode d’Edman pour reconstruire une séquence

Answer 70

En résumé, lorsqu’on séquence une protéine par la méthode de dégradation d’Edman, on doit
commencer par briser les ponts disulfures et les interactions non covalentes qui lui confèrent sa
structure tridimensionnelle. Les différentes chaînes formant la protéine sont ensuite séparées. On
utilise une partie de chacun de ces échantillons pour déterminer la composition de chaque chaîne. La
nature des résidus aux extrémités est ensuite analysée en utilisant une autre partie des échantillons.
Finalement, chaque chaîne est clivée en courts fragments dont les séquences sont ensuite déterminées
par la méthode de dégradation d’Edman. Il faut obtenir les séquences d’au moins 2 séries de
fragments différents afin de pouvoir reconstruire la séquence complète de chaque chaîne.

Question 71

Comment localise t-on les ponts disulfures et pourquoi le faire (étape 8)?

Answer 71

En résumé, lorsqu’on séquence une protéine par la méthode de dégradation d’Edman, on doit
commencer par briser les ponts disulfures et les interactions non covalentes qui lui confèrent sa
structure tridimensionnelle. Les différentes chaînes formant la protéine sont ensuite séparées. On
utilise une partie de chacun de ces échantillons pour déterminer la composition de chaque chaîne. La
nature des résidus aux extrémités est ensuite analysée en utilisant une autre partie des échantillons.
Finalement, chaque chaîne est clivée en courts fragments dont les séquences sont ensuite déterminées
par la méthode de dégradation d’Edman. Il faut obtenir les séquences d’au moins 2 séries de
fragments différents afin de pouvoir reconstruire la séquence complète de chaque chaîne.

Question 72

Quesque la spectroscopie de masse en tandem MS/MS?

Answer 72

Il s’agit de 2 spectromètres de masse séparés par une cellule de collision. Les fragments peptidiques
sont vaporisés par ESI ou par MALDI; ils passent ensuite dans un premier spectromètre qui nous
donne leur ratio masse/charge. Un par un, les fragments sont dirigés vers une cellule de collision où
des molécules de gaz inerte viennent les fragmenter en plus petites molécules. Tous ces produits
passent dans un 2 ieme
spectromètre où leurs masses sont déterminées.

Question 73

Quesque « empreinte de masse peptidique » ou « peptide mass fingerprinting » ?

Answer 73

Par comparaison des masses obtenues avec les masses théoriquement possibles pour les protéines
disponibles dans les bases de données, on peut déterminer les séquences des fragments peptidiques et
identifier la protéine correspondante. En français, on appelle cette technique de comparaison
« empreinte de masse peptidique », mais l’emploi du terme « peptide mass fingerprinting » est
fréquent.
Cette technique a remplacé la dégradation d’Edman comme méthode principale de détermination de
la structure primaire des protéines. C’est une méthode de choix, car la spectrométrie de masse est très
sensible et nécessite moins d’étapes. Lorsqu’on utilise la spectrométrie de masse et l’empreinte de masse peptidique pour obtenir la
séquence d’une protéine, les chaînes polypeptidiques ainsi que les fragments n’ont pas besoin d’être
séparés avant l’analyse. De plus, l’analyse d’une seule série de fragments est généralement suffisante.
Finalement, il est inutile de déterminer la composition des chaînes polypeptidiques ainsi que la nature
de leurs extrémités pour obtenir une séquence complète avec cette méthode.