Microscopie photonique

Question 1

Définition

Limite de résolution

Answer 1

+petite distance devant séparer 2 objets pour qu’ils apparaîssent distincts à l’obs.

Question 2

Limite de résolution

• oeil humain
• loupe binoculaire
• microscopie photonique

Answer 2

• oeil humain: 75µm
• loupe binoculaire: 3µm
• microscopie photonique: 0.25µm (jsk 0.15µm en UV)

Question 3

La résolution du mPhotonique est limitée par les caract. physique de la lumière, d’après la formule…

Answer 3

R = 0.61 λ / nsin(α)

• α: demi angle d’ouverture de la lentille
• n: indice de réfraction
• λ : longueur d’onde de la lumière

Question 4

La résolution est d’autant plus faible que la longueur d’onde est … , elle sera améliorée par un éclairage …

Answer 4

La résolution est d’autant plus faible que la longueur d’onde est courte, elle sera améliorée par un éclairage monochrome

Question 5

La loupe

Answer 5

• permet d’observer surface d’objets opaques, également observation par transparence
• grossissement ne dépasse pas 150 fois
• résolution 3µm environ

Question 6

Microscopie photonique

Answer 6

observation par transparence, lumière qui traverse l’objet constitue image.

1. matériel à obs. sur lame de verre
2. reçoit lumière de la source lumineuse par l’int. du condenseur
3. lumière recueilli par obj: lentilles agrandissent image une 1ere fois
4. image int. recueilli par l’oculaire qui réalise 2ème agrandissement = image visible

chaque obj a grossissement fixe [4;100]; oculaire [10;12.5]; donc grossisement total [40;1250]

Plus le grossissement /> ; plus la profondeur de champ <\ , ainsi objet doit être relativement transparent et peu épais (qq µm)

Question 7

microscope inverse

Answer 7

• même principe que photonique classique mais lumière incidente éclaire objet par le haut et obj en dessous
• permet d’observer à travers le fond d’une boite transparente, les ¢ en culture

Question 8

Contraste de phase

Answer 8

matériel biologique pratiquement incolore mais réfringent => dévie les rayons lumineux

le contraste de phase permet de sélectionner la lumière déviée par l’objet

principe:

• un anneau clair est placé avant le condenseur, un anneau sombre derrière l’obj ainsi, si il n’y a pas de déviation, la lumière devrait se projeter directement sur l’anneau sombre = pas d’image
• ainsi, le matériel biologique étant réfringent, il dévie une partie de la lumière en dehors de l’anneau sombre = image.

utilisation: obs cellules vivantes, cultures…

Question 9

Contraste interférentiel

Answer 9

dispostif optique complexe qui crée des interférences lumineuses en LP(lumière polarisée)

principe:

• lumière directe réduite par interférence
• lumière qui traverse objet, retardée par Δn est transmise

images d’excellente qualité, impression de relief, contrairement au constraste de phase, résolution du microscope est préservée, profondeur de champ de l’ordre de 0.3µm => coupes optiques de l’objets

Question 10

fond noir

Answer 10

condenseur particulier, opaque au centre

principe:

les rayons lumineux qui sortent en périphérie ont un trajet très incliné et n’arrivent pas sur la lentille de l’objectif. Seule la lumière déviée par objet peut etre observée

utilisation en bactériologie

Question 11

la polarisation

Answer 11

propriété d’orienter le plan de vibration de la lumière

• lame polarisante (polariseur) entre source et condenseur, oriente la lumière dans un seul plan
• deuxième lame (analyseur) identique placée après objet

permet de voir les structures microscopiques qui dévient le plan de l’onde lumineuse qui les traverse: polarisantes ou biréfringentes

Question 12

fluorescence

Answer 12

• propriété des molécules dites fluorescente d’emettre des photons de plus basses énergie (plus grande longueur d’onde) que les photons de la lumière incidente (excitatrice).
• Longueurs d’onde d’excitation et d’émission sont spécifiques d’une molécule donnée

Question 13

épifluorescence

Answer 13

1. la lumière excitatrice est sélectionnée par filtres colorées
2. miroir semi transparent la dirige sur l’objet à travers objectif
3. l’objectif recueille la lumière de fluorescence émise par l’objet
4. cette lumière traverse le miroir semi transparent et est sélectionnée par d’autres filtres colorés adaptés à sa longueur d’onde = image observable

Question 14

microscope confocal

Answer 14

• perfectionnement du microscope photonique
• éclairage par balayage laser de l’objet par un faisceau émis par le laser.
• résolution améliorée et surtout cela permet de réaliser de véritables coupes tomographiques de la structure par coupe de 0.5µm environ => ttt info => reconstitutions tridimensionnelles

Question 15

La fixation

Answer 15

arrête les réa biologiques, fige le matériel et le durcit (facilite la coupe)

technique:

• chaleur et dessications parfois utilisées
• le plus souvent, fixation chimique à l’aide de petites molécules qui diffusent au sein du matériel

+ pièce petite, + fixation rapide et de meilleure qualité (1mm/h)

Question 16

fixateurs

Answer 16

différents fixateurs que l’on peut regrouper par action:

précipitation des protéines:

• alcools (méthyliques, ethyliques) et acétone coagulent les protéines
• acide acétique: coagulation variable des prot (bonne nucléaire, cyto moins bon)

pontages chimiques entre les prot

• acide picrique, formol, glutéraldéhyde permettent pontages par liaison covalentes entre les chaines protéiques
• tétroxyde d’osmium est utilisé pour fixer les lipides, asso avec gluteraldéhyde pour prépa mE-

en routine: formol tamponné et liquide de Bouin (acide picrique, formol, acide acétique)

Question 17

inclusion

Answer 17

assure consistance homogène de l’ensemble du frag tissulaire lors de la coupe, excellente conservation du fragment de tissu, en microscopie photonique on utilise la paraffine hydrophobe

1. à partir du fixateur en sol aqueuse, la pièce histo doit être déshydratée par plusieurs bains d’alcools de [croissante] jsk alcool pur, puis bains de solvant organique (toluène ou xylène)
2. transferée dans la paraffine liquide qui se substitue au solvant
3. on laisse refroidir et on obtient bloc solide renfermant la pièce, fixée et déshydratée, qui sera coupée

36 à 48 H au minimum pour petites pièces

Question 18

coupe

Answer 18

s’effectue à l’aide d’un microtome, coupe [4;6]µm

Question 19

coloration des coupes

Answer 19

• s’effectue grâce à des colorants en solution aqueuse ou alcoolique
• ne diffusent pas dans la paraffine, nécessite que lame soit déparaffinée (schéma inverse que pour inclusion)

Question 20

la technique d’immersion

Answer 20

• améliore l’observation
• de l’huile de même n(indice réfract.) déposée entre condenseur et la lame d’une part et entre lamelle et objectif de l’autre part, assure cheminement homogène des rayons lumineux
• c’est dans ces conditions que l’on peut atteindre les limites théoriques de la microscopie photonique

Question 21

inconvénients inclusion paraffine

Answer 21

• lente: au mini 48H entre début fixation et observation des premières lames colorées
• petites molécules libres (aa, monosaccharides…) dissoutes par les diff bains
• lipides dissous par bains de solv orga
• fixat° arrête les A(biologique), en particulier enzymatiques
• fixat° modifie la conformat° des molécules et perturbe leur reconnaissance par des Ac

Question 22

coupes en congélation

Answer 22

permet d’éviter la fixation et l’inclusion, se réalise à l’aide de cryo microtome à -20°C

qualité des coupes est moindre mais plusieurs utilités:

• mise en évidence des mol non obs en histo classique (molécules qui sont détruites ou extraites)
  
  • lipides: colorables au noir de soudan
  • petites molécules
  • Ag (dénaturés en histo classique)
• rapidité de mise en oeuvre: diagnostic extemporané, coloré rapidement au bleu de toluidine par ex qui ne nécessite pas de fixation

Question 23

colorations vitales

Answer 23

colorations utilisables sur des cellules vivantes

• certains sont phagocytés, encre de chine (suspension colloïdale de carbone): permet de mettre en évidence le système phacoytaire mononucléé.
• d’autrex colorants vitaux diffusent à travers les mb, souvent toxiques, ex: bleu de Nil
• d’autres colorent cellules non fixées mais mortes prcq leur mb est perméable (bleu de trypan)

Question 24

Une molécule de colorant acide se fixera sur des molécules basiques et ce d’autant plus que le pH de la solution sera ..

Les structures riches en radicaux basiques sont appelés acidophiles. Ainsi les prot cytoplasmique se colorent par …

Answer 24

Une molécule de colorant acide se fixera sur des molécules basiques et ce d’autant plus que le pH de la solution sera acide

Les structures riches en radicaux basiques sont appelés acidophiles. Ainsi les prot cytoplasmique se colorent par l’érythrosine en rose ou rouge , en orange par l’éosine, en vert par la lumière

Question 25

Une molécule de colorant basiquese fixera sur des molécules acides et ce d’autant plus que le pH de la solution sera ..

Les structures riches en radicaux basiques sont appelés acidophiles. Ainsi lesacides nucléiques se colorent par …

Answer 25

Une molécule de colorant acide se fixera sur des molécules basiques et ce d’autant plus que le pH de la solution sera basique

Les structures riches en radicaux acides sont appelés basophiles. Ainsi les acides nucléiques se colorent en brun par l’hémtoxyline (hémateine), et en bleu par le bleu de toluidine