microscopia eletrónica Flashcards
Diferenças entre o ME e o MO
Fonte de iluminação : microscopia de luz usa-se fotões e na microscopia eletrónica usa-se eletrões.
lentes : para os eletrões
não podemos usar lentes de vidro, temos de usar lentes eletromagnéticas.
Visualização : e quando temos um microscópio de luz olhamos diretamente para o microscópio e
conseguimos ver a imagem, não é preciso uma câmara.
Tipos de ME
Varrimento e transmissão
Varrimento correspondem às que nós conseguimos ver a superfície.
Neste caso temos umas células ciliadas e conseguimos ver o exterior da célula e os cílios da célula.
Na microscopia de transmissão já implica o corte das amostras a fim de conseguimos ver as estruturas interna.
Microscópio Eletrónico de Varrimento (SEM)
Neste tipo de microscópio, temos a
amostra, os eletrões vão partir da coluna e tocar na amostra. Quando tocam na amostra, os eletrões são disparados e, depois, há uma
câmara que deteta todos os eletrões à volta que foram disparados. Quanto mais escura for a amostra, o eletrão vai ser disparado de uma maneira mais escura, não é tão rapidamente disparado. As áreas que se vê a
branco, por exemplo os cílios, são as áreas que são eletrodensas, sendo que muitos eletrões acabam por bater naquela área.
exemplos do porquê de usarmos o microscópio eletrónico de varrimento.
*Microestruturas das plantas
* Brotamento viral de células infetadas
* Contaminações de superfície
* Análises químicas qualitativa e
estruturas cristalinas
* Avaliação dos danos materiais
subsequente a um impacto.
Microscópio Eletrónico de Transmissão (TEM)
Os eletrões atravessam a amostra. Se a amostra for muito clara os eletrões passam muito rapidamente, se a amostra for mais escura significa que é mais densa, logo os eletrões
têm dificuldade em atravessar. Por este motivo, as zonas que têm mais eletrões, ou seja, que são mais eletrodensas, neste tipo de microscopia é totalmente ao contrário que na microscopia de varrimento, pois apresentam-se como zonas mais
escuras.
Desafios de preparação da amostra para TEM
Composição
* Densidade eletrónica fraca
* Vácuo não é compatível com a água
Degradação - Estes microscópios trabalham ao vácuo o que significa que amostras com água não são
compatíveis com o vácuo, por isso, temos de desidratar as amostras.
* É necessário fixação ou imobilização
Complexidade
* Protocolos demorados
* Não tem protocolos padrão
* Baseado em artefactos
Espessura
* Os eletrões são bloqueados
A preparação do tecido pode ser de duas maneiras
Fixação quimica - mais lento. Elevado output
Crio-imobilização- Mais rápido, confere melhor caracteristicas, baixo output
Tipos de preparação quimica
Processo convencional
Coloração negativa
Tokuyasu
Processo convencional
1- Fixação com aldeidos ( formaldeído e glutaraldeído)
2- Fixação secundária com tetróxido de ósmio para fixar os lipidos
3- Adicionar eletrodensidade ( cor) com acetato de uranilo ( radioativo)
4- Desidratação que pode ser com acetona ou etano
5-Infiltração em resina e não em parafina
6- Inclusão
7- Microtomia
8- coloração ( acetato de uranilo e citrato lead )
9-observação
Coloração negativa
Se tivermos uma amostra que é extremamente fina, mesmo sem
ser cortada, se esta se consegue ver diretamente no microscópio não
precisamos de a cortar. Coisas muito pequenas como microtúbulos,
bactérias, bacteriófagos, vírus conseguem ser vistos diretamente no
microscópio.
A amostra é colocada na grelha do TEM e corada imediatamente antes da observação ao microscópio.
Tokuyasu
É a técnica gold standard para imunomarcação.
* A fixação é feita sem recorrer a metais pesados.
* A amostra permanece hidratada.
- fixação com formaldeido
2.pulnge freezing - criotomia ( -120ºC)
4.Imuno-labelling - Observação
TEM
Tomografia
Nesta técnica conseguimos virar a nossa amostra em vários ângulos e conseguimos ver a estrutura toda, ou seja, uma amostra de 70 nm, nós conseguimos dividi-la em 120 fatias no
microscópio que depois são reconstruídas em computado
CLEM
É uma técnica que permite conjugar a microscopia eletrónica com a ótica. Conseguimos ver exatamente a mesma célula da mesma fatia numa microcopia e noutra.
Vantagens do CLEM
Conseguimos o bom dos dois mundos. Podemos obter o melhor de
várias técnicas que devem aumentar a qualidade dos dados e
validade das conclusões científicas.
Desvantagens CLEM
- Demoram muito mais tempo que as técnicas convencionais.
- Um dia inteiro para ver 1 amostra.
- Produção de amostra muito baixa.
