Microdissecação por captura laser

Question 1

Existem dois tipos de laser, quais são e para que servem cada um :

Answer 1

Laser UV - mais utilizado para
remoção de grupos de células

Infravermelho é
usado para a remoção de pequenos grupos ou mesmo uma única célula.

Question 2

É uma técnica que permite isolar populações _____ de uma amostra de tecido _________.

Answer 2

puras , heterogéneo

Question 3

O contato com o laser preserva a morfologia das células e seu
________, permitindo _______-. Muitas análises são análises moleculares, seja a nível de genoma, de proteína, etc. Muito na área de DNA, RNA e proteómica.

Permite o estudo de _________de células de tecidos através de
visualização microscópica.

Answer 3

Material genético, análise molecular , subpopulações

Question 4

Qual é a constituição das plataformas automatizadas ? (4)

Answer 4

-Microscópio de luz invertida (com ou sem módulo fluorescente,
sendo que tal vai depender do estudo)
-Dispositivo laser (unidade de controlo laser – joystick)
-Plataforma para imobilização a vácuo da amostra
- Câmara, monitor e PC.

Question 5

Qual é o máximo e o minino do feixe de laser ?

Answer 5

minimo 7,5 picometros
máximo 30 picometros

Question 6

Temperatura máxima do laser

Answer 6

70ºC

Question 7

sistema de microdissecação por captura de
laser infravermelho (IV)

Answer 7

sistema PixCell

Question 8

Como funciona a plataforma PixCell ?

Answer 8

1 Colocação de membrana termolábil (vai ser recetiva à temperatura e vai derreter para envolver as células e faz uma solução membrana células) transparente (para continuar a ter visualização das células e não existir nenhuma refração de luz) e fina, sobre a secção histológica.
- O tecido é visualizado microscopicamente.
-As células alvo aderem seletivamente à membrana através de um impulso laser (IV) focal de curta duração.
Vamos ter a membrana, a lâmina, um laser que vai incidir na zona que selecionamos previamente e são as células que estão nessa zona que vão aderir à membrana. Como o
laser está circunscrito àquela área é só esta área termolábil que aquece e as células ficam, então, envolvidas na membrana.
- A aderência das células à membrana supera a aderência à lâmina de vidro, o que permite a remoção seletiva das células de interesse
- As células removidas são destacadas levantando a membrana e são transferidas para um microtubo com solução tampão (de extração) para isolamento de DNA ou RNA.

Question 9

PALM Zeiss

Answer 9

UV LCM

• Solução tampão é usada na cap
• Usa tecido numa lâmina de vidro específica (temos um bloco, onde vamos retirar um corte e colocar numa lâmina própria) que possui uma membrana (com cerca de 6 μm)
  na qual o tecido é colocado, e para a qual é direcionado um feixe de laser UV.
• O laser UV é usado para “desenhar” um contorno em volta da/s célula/s de interesse, deixando esta população intacta.
• Ao aumentar a potência do laser as células alvo são catapultadas, contra a gravidade, para um tubo com tampão de lise.

Question 10

Arcturus veritas TM

Answer 10

Exemplo de sistema combinado IR / UV

Question 11

Fontes de tecido para LCM

Answer 11

Podem ser surgical specimens de :
- blocos de parafina
- tecidos congelados.

Ou de citologia :
- esfregaços ,
- thin prep
- cell block
- citospin

• laminas histologicas
  -Cytospin
• nivel cromossomico = No caso do estudo dos cromossomas colocamos a amostra no cap (tampa) do
  microtubo, incubamos e centrifugamos e vamos t erisoladamente aquilo que nós queremos para fazer o estudo de DNA, RNA ou de proteínas.
• cultura de células

Question 12

quais são os vários tipos de microdissecação?

Answer 12

(A) Podemos ter o contacto através de membranas que vão promover uma adesão

(B) Podemos ter uma força que vai deslocar as células e com a força da gravidade elas são coletadas

(C) E depois temos
contra a força da gravidade em que
vamos ter uma força que vai catapultar as células e vão ser coletadas no cap do microtubo

Question 13

Para que serve a substância corante no polimero ?

Answer 13

-Absorva a energia laser, prevenindo danos nos constituintes
celulares.
-Auxilie a visualização das áreas derretidas do polímero.

Question 14

Leica LMD6 e LMD7

Answer 14

É possível fazer apenas neste microscópio toda a
microdissecação a laser por UV.

Question 15

Fatores que influenciam a recuperação de DNA, RNA e proteínas de células microdissecadas, tais como:

Answer 15

• Qualidade da amostra.
• Tempo de preservação antes da microdissecação.
• Tipo de preservação.
• Método de fixação.
• Eficácia da microdissecação. É inerente à técnica, por exemplo, se o polímero derrete
  como deve ser, etc

Question 16

Aplicações da microdissecação

Answer 16

• Perfil molecular do tecido.
  -Avaliação das interações entre tumor e microambiente.
  -RT-PCR.
  -Perfil molecular proteómico.
  -Perfil molecular genómico.
• Biologia de doenças infeciosas.
  -Biologia celular de plantas.