Métodos de diagnóstico: Peste Suína Africana Flashcards
Que amostras recolhes e em que tubos?
Sangue
– Anticoagulante
* EDTA
* Não usar Heparina (não dá para PCR)
* Citrato de Na
Soro
Como conservas as amostras?
Refrigeração (4ºC)
Congelação
– 20ºC
– 80ºC
* CO2
amostras (4ºC), DNA (-20ºC), vírus (-80º)
Diagnósticos diferenciais
Peste Suína Clássica
Salmonelose
Mal rubro
PRRS
Doença de Aujeszky
Estratégia geral de diagnóstico da PSA
Doença ativa:
-Diagnóstico virológico
–Isolamento do VPSA
—Culturas de macrófagos de suíno
—Inoculação de suínos
–Deteção VPSA
—Hemadsorção
—Imunofluorescência direta
—PCR
—ELISA
—Lateral Flow Assay (LFA)
-Pesquisa de anticorpos: ELISA indireta e Imunofluorescência indireta
Diagnóstico em formas clínicas assintomáticas ou sobreviventes (portadores)
PCR + ELISA indireta / imunofluorescência indireta
Confirmação:
-Immunoblotting
-Imunoperoxidase
O que é se verifica no isolamento viral?
-Efeito citopático por vírus não hemadsorvente
-Hemadsorção, em culturas de macrófagos, por expressão de recetor CD2 para glóbulos vermelhos
Como transportar amostras a -80ºC?
CO2
Que testes de diagnóstico fazemos?
PCR, hemadsorção, Imunofluorescência directa, ELISA, Lateral Flow Assay (LFA), immunoblotting e Imunoperoxidase
Protocolo da imunofluorescência direta
A imunofluorescência direta deteta antigénios, por utilização de anticorpos específicos, associados a um fluorocromo;
o fluorocromo, após excitação com luz UV, emite fluorescência, que pode ser observada num microscópio próprio.
Para esta técnica, é feito um esfregaço de macrófagos infetados com PSA, fixados com acetona a -18ºC. Os macrófagos são incubados com soro anti-PSA (com o anticorpo específico), conjugado com isoticianato de fluoresceína –
FITC – (o fluorocromo), a 37ºC, durante 30 minutos. Após lavagens sucessivas, é observado ao microscópio de
fluorescência.
Diferença entre imunofluorescência direta e indireta?
Imunofluorescência direta: faz pesquisa de antigénios em esfregaços de órgãos
Imunofluorescência indireta: faz pesquisa de anticorpos; utiliza sobrenadantes de macerados de órgãos, soros, etc
Protocolo da imunofluorescência indireta
A imunofluorescência indireta detetam-se anticorpos, por meio do antigénio fixado em lâmina. A este conjunto vai ligar-se um segundo anticorpo, associado a um fluorocromo.
Neste caso, células da linha contínua, infetadas com VPSA adaptado são fixadas por acetona a -18ºC. É adicionado o
sobrenadante de órgãos com anticorpos contra a PSA, ou soro de um animal suspeito. Este conjunto é incubado durante
30 minutos, a 37ºC e é posteriormente lavado. Após a lavagem, é incubado com soro anti-anticorpo suíno, conjugado
com FITC, é submetido a luz UV e é visualizado ao microscópio de fluorescência.
Protocolo imunoperoxidase
Semelhante ao da imunofluorescência mas tem uma enzima em vez de fluoresceina e muda de cor
Protocolo immunoblotting/ western blot
- Temos um extrato proteico de tecido ou cultura celular infetado
- Coloração do gel para ver todas as proteínas no gel ou western blotting para detetar proteínas específicas
- Transferência para membrana (com catião e anião)
- Bloqueia da membrana
- Incubação com Ac primário (específico para PSA)
- Incubação com Ac secundário (específico para Ac primário)
- Incubação com agentes de deteção e revelação das bandas específicas de PSA - bandas específicas ficam visíveis
Pergunta sobre Anticorpos, se surgem cedo ou tarde
Podemos ter animais que nunca se seroconvertem se forem infetados por uma estirpe muito virulenta
(Nota: vírus não induz a produção de anticorpos neutralizantes)
Que títulos as infeções podem atingir e quantos ciclos de PCR se fazem?
abaixo dos 30 ciclos, títulos considerados muito altos
Que amostras podemos utilizar?
sangue ou soro
baço
linfonodos
tonsilas
rim
pulmão
medula óssea
fluidos orais
(rastreio em suínos domésticos e javalis)
cadáver: recolher ossos longos
sangue colhido da cavidade torácica ou seio cavernoso
se já em putrefação utilizar técnicas de diagnóstico molecular
