Metoder Flashcards
Hur kan man screena för icke-kodande RNA? (Sekvenser, Microarray detection, shotgun kloning, Hfq binding, sekvensering)
Leta efter konserverade sekvenser (funktion, struktur), promotorer eller terminatorer (transkriberas fortfarande).
Microarray detektion = Prov hybridisera till immobiliserade oligos –> signal. Allmän om slump oligo.
Shotgun kloning: Klona in cDNA i plasmid - se vad som uttrycks.
Hfq bindning: sRNA binder till Hfq –> rena ut för att hitta potentiellt.
Sekvensering: Mappa transkriptom mot känt genom - hitta i icke-kodande eller extra inom gener.
Redogör för följande NSG tekniker för DNA sekvensering: 454, Ion torrent, Illumina, SMRT
454: Templat binds till kula (immobilisera) –> syntetisera ny strand –> inkoporering frigör PPi (pyrofosfat) –> via sulfurylase blir ATP –> används av luciferas för att luciferin –> oxyluciferin och ljus –> mätbart!
Ion torrent: Som 454 men detekterar H+ som frigörs vid inkorporering. Begränsat användningsområde eftersom främst studerar exoner.
Illumina: DNA immobiliseras i flödescell + amplifieras till kluster –> syntes av ny strand med flourescenta dNTPs (reversibla terminatorer). Note: Användning av kluster minskar read-längd för att undvika ur-fas.
SMRT: Immobiliserat DNA-polymeras syntetiserar direkt ny strand med flourescenta dNTPs –> modifieringar på originalet försvinner inte genom amplifiering (sekvensera en molekyl) 😊
[Sekvensering] Vad är paired-end sekvensering?
En metod för att avgöra vilka reads som ligger på ett visst avstånd från varandra (bra vid repeats). DNA delas upp i fragment av viss storlek –> cirkulariseras via adaptrar –> klyv cirkel (ändar brevid adaptrar hamnar nära varandra) –> sekvenser och lägg till tidigare känt avstånd.
Hur kan RNA sekvenseras på oliak sätt (5’, total, 3’)?
(Transkriptom isolerat)
Total: Fragmentera –> TAP –> ligera adaptrar –> sekv.
5’: Fragmentera –> TEX (ta bort alla utan “äkta” PPP ände) –> TAP –> ovan. Kan också hittas genom att ligera direkt och sedan jämför för avsaknad mot total.
3’: Ligera 3’ adaptor –> fragmentera –> adaptor –> amplifiera med 3’ adaptor primer i PCR.
[RNA seq] Om man hittar många 3’ ändar i 5’ UTR av en gen, vad betyder det?
Att det finns en reglerad terminering där, ex. riboswitch eller attenuator.
Vad är ribosome profiling?
Metod för att studera translation (initiering, position mm.). Degradera allt RNA som inte skyddas av ribosomer –> se var dessa varit.
CLIP-seq kan användas för att studera RNA-protein interaktioner, hur?
Krosslänka (kovalent) RNA och protein mha UV –> rena ut stringent mha immunoprecipitation –> sekvensera och hitta var protein bundit. RNa också märkt med radioaktivitet - används för att studera på gel.
Krosslänkning ger mutation på just den basen - möjligt att se var det skett.
Vad är RIL-seq?
CLIP fast för RNA-RNA interaktione. Görs på samma sätt förutom att RNA ligeras med varandra och sedan mappas reads från vardera håll mot genom för att se var gränsen går för ligeringen.
Vad är ChIP-seq?
Som CLIP-seq fast undersöker DNA-protein interaktioner.
High-throughput mutagenes används för att studera vilka gener som är vitala och post-transkriptionell reglering via sRNA. Hur går detta till?
Utnyttja transposoner som kan flytta på sig och inkorporera sig annanstans. Lägger sådan på plasmid –> massvis i population (bib) –> sekvenser –> väx –> sekvenser –> se vilka insättningar som överlevt och vilka som inte - ger vitala gener/selektion.
Post-transkriptionell reglering via sRNA i 5’ UTR genom att skapa ~1 mutation i 5’ UTR per plasmid –> in i cell –> analysera uttryck via GFP. Ex. visa att SD kan man ändra i för att göra det mer optimalt.
Proteogenomik kan användas för att identifiera proteiner som binder till RNA. Hur görs detta?
Studera RNA interactome genom att fånga upp mRNA via poly-dT (fungerar i bakterier också) –> krosslänka –> rena –> degradera RNA –> MS för protein
Vad är gradient sekvensering?
Metod för storskalig identifiering av RNA-protein komplex. Centridugera –> gradient av komplex på storlek –> ta ut från vardera del och RNA-seq + MS –> ta reda på vilka proteiner och RNA som finns i varje fraktion – > möjliga komplex.
Vad är Western Blot?
Metod för att studera proteinbindning med hjälp av antikroppar (GFP) - vad förekommer i ett prov mm.
Vad är electromobility shift assay?
Gelelektrofores men utan denaturering - hur stora komplex det är och formen spelar roll.
Vad är surface plasmon resonance?
Metod för att studera om något binds in. Molekyl immobiliserad på guldyta ger upphov till spridning av ljus som skickas på den. Om något binder till molekylen kommer spridningen att ändras –> annan signal
