Metode proučevanja celic Flashcards
Kaj je znanstvena metoda? Naštej faze znanstvene metode.
Je eksperimnetalno testiranje hipoteze, ki je oblikovana na podlagi sistematičnega in objektivnega zbiranja podatkov. Faze so: -Opazovanje -postavljanje vprašanja -oblikovanje hipoteze -napoved izida poskusa - poskus -analiziranje dobljenih opdatkov -ovrednotenje hipoteze
Kakša je ločljivost za svetlobni in elektronski mikroskop? Kakšne celice lahko opazujemo z njima?
svetlobni-0,2 mikrometra (200nm); fiksirane in žive celice, elektronski-1nm; samo fiksirane celice
Katere metode opazovanja fiksiranih celic poznamo?
Histokemijske metode (barvilo se specifično veže na neko kemijsko sestavino v celici-> produkt je stabilen in netopen; ne sme spremeniti lokacije v celici)
encimsko histokemijo (encim naredi produkt iz substrata na katerega se veže barvilo-> nastane končni substrat, ki je netopen, stabilen)
imunohistokemijo (protitelo z označevalcem se veže na specifično molekulo)
avtoradiografijo (posamezne kemične sestavine celice označimo z radioaktivnim izotopom)
hibridizacijo in situ (ugotavljanje specifičnih zaporedij RNA in DNA)
Naštej faze priprave vzorcev za svetlobno mikroskopijo.
- odvzem materiala
- fiksacija
- spiranje in dehidracija
- vklapljanje v parafin
- rezanje histoloških rezin
- rehidracija
- barvanja
Naštej načine fiksacije
- fizikalna (sušenje na zraku, zamrzovanje s tekočim dušikom)
- kemična (alkoholi: metanol & etanol; aldehidi: formalin, glutaraldehid*)
- mešanice fiksativov z dodatki za lažje prodiranje (Carnoy: etanol, kloroform in ledocetna kislina; Bouin: pikrinska kislina, formaldehid in ledocetna kislina)
Naštej načine vnosa fiksativa
- fiksacija z imerzijo (razmerje vzorec: fiksativ vsaj 1:5 /1:10)
- fiksacija s perfuzijo (fiksativ vneseš v krvni obtok)
Kako potekata spiranje in dehidracija?
S formalinom fiksirane vzorce spiramo z vodo. Z alkoholom fiksirane pa z alkoholom. Dehidracija poteka z alkoholom v naraščujočih koncentracijah (80%, 96% x2, 100% x3)
Kako poteka presvetlitev? Kaj se zgodo s tkivom v procesu?
Absolutni alkohol (po dehidraciji) zamenjammo z organskim topilom (kloroform, benzol, sintetični nadomestki (Ultraclear, Neoclear). Tkivo se dokončno dehidrira, postane prosojno.
Kako poteka in kaj je naloga vklaplanja v parafin?
Najprej tkivo impregniramo s parafinom (da se ohrani medsebojni odnos strukktur v tkivu), nato tkivo zalijemo s parafinom. Bloke parafina razrežemo z mikrotomom na histološke rezine
Kako poteka rezanje na histološke rezine
z mikrotomom narežeš na 5-7 mikrometrov debele rezine; daš v vodno kopel (42 stopinj C), da se rezina raztegne; z apesom povlečeš na predmetno stekelce; posušiš preparat
Kako poteka rehidracija?
najprej deparafiniziramo preparat, po tem damo v padajoče koncentracije alkohola vse do vode, speremo še v destilirani vodi.
Kako poteka HE barvanje
Naštej kisla barvila (in katere barve so). Kako delujejo? Kako rečemo obarvanju s kislimi barvili?
Eozin (rdeča), kisli fuksin (rdeča), anilinsko modrilo (modra), oranžno G (oranžna). Kisla barvila reagirajo s kpozitivnimi komponentami celic (ponavadi z NH3+=amino skupino proteinov).
Acidofilija.
Naštej bazična barvila (in katere barve so). Kako delujejo? Kako rečemo obarvanju z bazičnimi barvili?
Tuloidinsko modrilo (modra), metilensko modrilo (modra), metil-zeleno (zelena), pironin G (rdeča). Reagirajo z negativnimi komponentami celic (PO4 fosfatne skupine (nukleinske kisline), sulfatne skupine SO4 (proteinoglikani) in –COOH (proteini)). Bazofilija.
Kako s pH vplivamo katere skupine so v ionizirani obliki?
pH>10: vse skupine v ionizirani obliki (COO- ,SO3-, PO3-
pH 5-7: SO3-, PO3-
pH <4: SO3-
Zakaj pripravimo zamrznjence, kako debele so rezine?
Da ne izgubimo oz. spremenimo dela celice, ki ga želimo opazovai (encimsko aktivnost, lipide, označevanje rezin s protitelesi). Debele so 10 µm.
Zakaj pripravimo zamrznjence, kako debele so rezine? S čim jih režemo?
Da ne izgubimo oz. spremenimo dela celice, ki ga želimo opazovai (encimsko aktivnost, lipide, označevanje rezin s protitelesi). Debele so 10 µm, s kriostatom.
Naštej posebnosti priprave tkiva za elektronsko mikroskopijo.
- velikost vzorca (1 mm3)
▪ fiksativ: glutaraldehid, fiksacija poteka pri 4°C
▪ postfiksacija z osmijevim tetroksidom
▪ vklopitev v umetno smolo (npr. Epon, Araldit)
▪ rezanje rezin z ultramikrotomom (debelina rezin 40 - 80 nm)
▪ prenos rezine na kovinsko mrežico
▪ kontrastiranje rezin (kombinacija svinčevega citrata in uranilacetat
Naštej in na kratko opiši vrste mikroskopov.
➢ mikroskopiranje na temnem polju (svetloba od strani, predmet vidimo kot obris v temnem polju- za enocelične organizme, alge, premikajoče objekte)
➢ faznokontrastni mikroskop
➢ polarizacijski mikroskop (polarizirana svetloba-> opazujemo vlakna po katerih se svetloba širi z različno hitrostjo npr. mišična, kolagenska, škrobna)
➢ fluorescenčni mikroskop (živosrebrova žarnica-namesto halogenske; filtri, ki prepuščajo le svetlobo nižje valovne dolžine-488 nm; predmet ima flurescirajoče molekule, ki se s to svetlobo ekcitirajo in oddajo svetlobo višje valovne dolžine-523 nm)
➢ konfokalni mikroskop (opazujemo 3 dimenzije celice-> z laserjem (helijneonski ali argonski) po plasteh skeniramo celice in sestavimo v 3D sliko; rezine debelejše od 10µm.-> do nekaj sto µm.)
➢ stereoskopski mikroskop (Za opazovanje makroskopskih preparatov in manjših organizmov. )
➢ invertni mikroskop (Opazovanje celičnih struktur neposredno v posodi (petrijevki), kjer rastejo. Osvetlitev od
zgoraj. Objektivi so pod mizico.)
➢ presevni (transmisijski) elektronski mikroskop, TEM(osvetlitev od zgoraj)
➢ vrstični (scanning) elektronski mikroskop
Naštej in na kratko opiši vrste mikroskopov.
➢ mikroskopiranje na temnem polju (svetloba od strani, predmet vidimo kot obris v temnem polju- za enocelične organizme, alge, premikajoče objekte)
➢ faznokontrastni mikroskop
➢ polarizacijski mikroskop (polarizirana svetloba-> opazujemo vlakna po katerih se svetloba širi z različno hitrostjo npr. mišična, kolagenska, škrobna)
➢ fluorescenčni mikroskop (živosrebrova žarnica-namesto halogenske; filtri, ki prepuščajo le svetlobo nižje valovne dolžine-488 nm; predmet ima flurescirajoče molekule, ki se s to svetlobo ekcitirajo in oddajo svetlobo višje valovne dolžine-523 nm)
➢ konfokalni mikroskop (opazujemo 3 dimenzije celice-> z laserjem (helijneonski ali argonski) po plasteh skeniramo celice in sestavimo v 3D sliko; rezine debelejše od 10µm.-> do nekaj sto µm.)
➢ stereoskopski mikroskop (Za opazovanje makroskopskih preparatov in manjših organizmov. )
➢ invertni mikroskop (Opazovanje celičnih struktur neposredno v posodi (petrijevki), kjer rastejo. Osvetlitev od
zgoraj. Objektivi so pod mizico.)
➢ presevni (transmisijski) elektronski mikroskop, TEM
➢ vrstični (scanning) elektronski mikroskop
Opiši presevni elektronski mikroskop, njegove prednosti in slabosti.
Deluje v vakumu (ker je za elektrone v zraku preveč trenja); ker imajo elektroni manjšo valovno dolžino od svetlobe ima mikroskop večjo ločljivost. Ločljivost je v idealnih pogojih 0,02 nm, v realnosti je 0,3 nm. Povečava je od 10 do 100 000 kratna. Mikroskop je drag, nekateri materiali so občutljivi na obstreljevanje z elektroni.
Opiši vir elektronov (oba načina)
Volframova nitka je katoda, ki ob segrevanju odda elektrone (termični način).
Tunelski pojav nastane tako, da uporabimo večji vakum in višjo pospeševalno hitrost. Elektroni se odcepijo z volframove nitke, če je dovolj velika razlika v električnem polju med konico in anodo. Dobimo miljonkrat krat več elektronov kot pri termičnem načinu. Pri tem je ločljivost 0,1 nm. So dražji.
