Metode proučevanja celic

Question 1

Kaj je znanstvena metoda? Naštej faze znanstvene metode.

Answer 1

Je eksperimnetalno testiranje hipoteze, ki je oblikovana na podlagi sistematičnega in objektivnega zbiranja podatkov.
Faze so:
-Opazovanje
-postavljanje vprašanja
-oblikovanje hipoteze
-napoved izida poskusa
- poskus
-analiziranje dobljenih opdatkov
-ovrednotenje hipoteze

Question 2

Kakša je ločljivost za svetlobni in elektronski mikroskop? Kakšne celice lahko opazujemo z njima?

Answer 2

svetlobni-0,2 mikrometra (200nm); fiksirane in žive celice, elektronski-1nm; samo fiksirane celice

Question 3

Katere metode opazovanja fiksiranih celic poznamo?

Answer 3

Histokemijske metode (barvilo se specifično veže na neko kemijsko sestavino v celici-> produkt je stabilen in netopen; ne sme spremeniti lokacije v celici)
encimsko histokemijo (encim naredi produkt iz substrata na katerega se veže barvilo-> nastane končni substrat, ki je netopen, stabilen)
imunohistokemijo (protitelo z označevalcem se veže na specifično molekulo)
avtoradiografijo (posamezne kemične sestavine celice označimo z radioaktivnim izotopom)
hibridizacijo in situ (ugotavljanje specifičnih zaporedij RNA in DNA)

Question 4

Naštej faze priprave vzorcev za svetlobno mikroskopijo.

Answer 4

1. odvzem materiala
2. fiksacija
3. spiranje in dehidracija
4. vklapljanje v parafin
5. rezanje histoloških rezin
6. rehidracija
7. barvanja

Question 5

Naštej načine fiksacije

Answer 5

• fizikalna (sušenje na zraku, zamrzovanje s tekočim dušikom)
• kemična (alkoholi: metanol & etanol; aldehidi: formalin, glutaraldehid*)
• mešanice fiksativov z dodatki za lažje prodiranje (Carnoy: etanol, kloroform in ledocetna kislina; Bouin: pikrinska kislina, formaldehid in ledocetna kislina)

Question 6

Naštej načine vnosa fiksativa

Answer 6

• fiksacija z imerzijo (razmerje vzorec: fiksativ vsaj 1:5 /1:10)
• fiksacija s perfuzijo (fiksativ vneseš v krvni obtok)

Question 7

Kako potekata spiranje in dehidracija?

Answer 7

S formalinom fiksirane vzorce spiramo z vodo. Z alkoholom fiksirane pa z alkoholom. Dehidracija poteka z alkoholom v naraščujočih koncentracijah (80%, 96% x2, 100% x3)

Question 8

Kako poteka presvetlitev? Kaj se zgodo s tkivom v procesu?

Answer 8

Absolutni alkohol (po dehidraciji) zamenjammo z organskim topilom (kloroform, benzol, sintetični nadomestki (Ultraclear, Neoclear).
 Tkivo se dokončno dehidrira, postane prosojno.

Question 9

Kako poteka in kaj je naloga vklaplanja v parafin?

Answer 9

Najprej tkivo impregniramo s parafinom (da se ohrani medsebojni odnos strukktur v tkivu), nato tkivo zalijemo s parafinom. Bloke parafina razrežemo z mikrotomom na histološke rezine

Question 10

Kako poteka rezanje na histološke rezine

Answer 10

z mikrotomom narežeš na 5-7 mikrometrov debele rezine; daš v vodno kopel (42 stopinj C), da se rezina raztegne; z apesom povlečeš na predmetno stekelce; posušiš preparat

Question 11

Kako poteka rehidracija?

Answer 11

najprej deparafiniziramo preparat, po tem damo v padajoče koncentracije alkohola vse do vode, speremo še v destilirani vodi.

Question 12

Kako poteka HE barvanje

Question 13

Naštej kisla barvila (in katere barve so). Kako delujejo? Kako rečemo obarvanju s kislimi barvili?

Answer 13

Eozin (rdeča), kisli fuksin (rdeča), anilinsko modrilo (modra), oranžno G (oranžna). Kisla barvila reagirajo s kpozitivnimi komponentami celic (ponavadi z NH3+=amino skupino proteinov).
Acidofilija.

Question 14

Naštej bazična barvila (in katere barve so). Kako delujejo? Kako rečemo obarvanju z bazičnimi barvili?

Answer 14

Tuloidinsko modrilo (modra), metilensko modrilo (modra), metil-zeleno (zelena), pironin G (rdeča). Reagirajo z negativnimi komponentami celic (PO4 fosfatne skupine (nukleinske kisline), sulfatne skupine SO4 (proteinoglikani) in –COOH (proteini)). Bazofilija.

Question 15

Kako s pH vplivamo katere skupine so v ionizirani obliki?

Answer 15

pH>10: vse skupine v ionizirani obliki (COO- ,SO3-, PO3-
pH 5-7: SO3-, PO3-
pH <4: SO3-

Question 16

Zakaj pripravimo zamrznjence, kako debele so rezine?

Answer 16

Da ne izgubimo oz. spremenimo dela celice, ki ga želimo opazovai (encimsko aktivnost, lipide, označevanje rezin s protitelesi). Debele so 10 µm.

Question 17

Zakaj pripravimo zamrznjence, kako debele so rezine? S čim jih režemo?

Answer 17

Da ne izgubimo oz. spremenimo dela celice, ki ga želimo opazovai (encimsko aktivnost, lipide, označevanje rezin s protitelesi). Debele so 10 µm, s kriostatom.

Question 18

Naštej posebnosti priprave tkiva za elektronsko mikroskopijo.

Answer 18

• velikost vzorca (1 mm3)
  ▪ fiksativ: glutaraldehid, fiksacija poteka pri 4°C
  ▪ postfiksacija z osmijevim tetroksidom
  ▪ vklopitev v umetno smolo (npr. Epon, Araldit)
  ▪ rezanje rezin z ultramikrotomom (debelina rezin 40 - 80 nm)
  ▪ prenos rezine na kovinsko mrežico
  ▪ kontrastiranje rezin (kombinacija svinčevega citrata in uranilacetat

Question 19

Naštej in na kratko opiši vrste mikroskopov.

Answer 19

➢ mikroskopiranje na temnem polju (svetloba od strani, predmet vidimo kot obris v temnem polju- za enocelične organizme, alge, premikajoče objekte)
➢ faznokontrastni mikroskop
➢ polarizacijski mikroskop (polarizirana svetloba-> opazujemo vlakna po katerih se svetloba širi z različno hitrostjo npr. mišična, kolagenska, škrobna)
➢ fluorescenčni mikroskop (živosrebrova žarnica-namesto halogenske; filtri, ki prepuščajo le svetlobo nižje valovne dolžine-488 nm; predmet ima flurescirajoče molekule, ki se s to svetlobo ekcitirajo in oddajo svetlobo višje valovne dolžine-523 nm)
➢ konfokalni mikroskop (opazujemo 3 dimenzije celice-> z laserjem (helijneonski ali argonski) po plasteh skeniramo celice in sestavimo v 3D sliko; rezine debelejše od 10µm.-> do nekaj sto µm.)
➢ stereoskopski mikroskop (Za opazovanje makroskopskih preparatov in manjših organizmov. )
➢ invertni mikroskop (Opazovanje celičnih struktur neposredno v posodi (petrijevki), kjer rastejo. Osvetlitev od
zgoraj. Objektivi so pod mizico.)
➢ presevni (transmisijski) elektronski mikroskop, TEM(osvetlitev od zgoraj)
➢ vrstični (scanning) elektronski mikroskop

Question 20

Naštej in na kratko opiši vrste mikroskopov.

Answer 20

➢ mikroskopiranje na temnem polju (svetloba od strani, predmet vidimo kot obris v temnem polju- za enocelične organizme, alge, premikajoče objekte)
➢ faznokontrastni mikroskop
➢ polarizacijski mikroskop (polarizirana svetloba-> opazujemo vlakna po katerih se svetloba širi z različno hitrostjo npr. mišična, kolagenska, škrobna)
➢ fluorescenčni mikroskop (živosrebrova žarnica-namesto halogenske; filtri, ki prepuščajo le svetlobo nižje valovne dolžine-488 nm; predmet ima flurescirajoče molekule, ki se s to svetlobo ekcitirajo in oddajo svetlobo višje valovne dolžine-523 nm)
➢ konfokalni mikroskop (opazujemo 3 dimenzije celice-> z laserjem (helijneonski ali argonski) po plasteh skeniramo celice in sestavimo v 3D sliko; rezine debelejše od 10µm.-> do nekaj sto µm.)
➢ stereoskopski mikroskop (Za opazovanje makroskopskih preparatov in manjših organizmov. )
➢ invertni mikroskop (Opazovanje celičnih struktur neposredno v posodi (petrijevki), kjer rastejo. Osvetlitev od
zgoraj. Objektivi so pod mizico.)
➢ presevni (transmisijski) elektronski mikroskop, TEM
➢ vrstični (scanning) elektronski mikroskop

Question 21

Opiši presevni elektronski mikroskop, njegove prednosti in slabosti.

Answer 21

Deluje v vakumu (ker je za elektrone v zraku preveč trenja); ker imajo elektroni manjšo valovno dolžino od svetlobe ima mikroskop večjo ločljivost. Ločljivost je v idealnih pogojih 0,02 nm, v realnosti je 0,3 nm. Povečava je od 10 do 100 000 kratna. Mikroskop je drag, nekateri materiali so občutljivi na obstreljevanje z elektroni.

Question 22

Opiši vir elektronov (oba načina)

Answer 22

Volframova nitka je katoda, ki ob segrevanju odda elektrone (termični način).
Tunelski pojav nastane tako, da uporabimo večji vakum in višjo pospeševalno hitrost. Elektroni se odcepijo z volframove nitke, če je dovolj velika razlika v električnem polju med konico in anodo. Dobimo miljonkrat krat več elektronov kot pri termičnem načinu. Pri tem je ločljivost 0,1 nm. So dražji.