méthodes moléculaires II Flashcards
quel est le principe de la méthode Sanger?
capillaire, didéoxy fluorescent. Détermine la séquence d’en gène connu pour trouver les mutations ou délétions présentes
avantages / désavantages de la méthodes Sanger?
AV: pas besoin connaître mutations/délétions, faible taux erreur
DÉS: cher, laborieux, sensibilité limité (tumeurs), limiter par la grosseur de la délétion
dans quel contexte on utilise le séquençage de nouvelle génération?
maladie rare, séquençage de l’exome
quelles sont les caractéristiques communes des GNS?
support solide, nbr très élevé de séquençage en parallèle, séquences plus courtes, taux d’erreurs plus élevés plus élevé
quel est le principe de la méthode 454?
détermination de la séquence par pyroséquençage. dénaturation et ajout d’adaptateurs à l’ADN. Émulsion pour hybridation à une “bille”. ajout d’un dNTP à la fois; si insertion = production de lumière via libération du pyrophosphate (VOIR DIAPO)
quel est le principe de bridge amplification (Illumina) ?
2 types d’adaptateurs sur la plaque. ADN prep hybride à un = polymérisation. dénaturation 2 brins complémentaires puis un “washed away”. adaptateur libre du brin restant s’hybride avec adaptateur très proche sur la plaque = polymérisation = génération de 2 brins complémentaires. même réaction répétée = formation de cluster avec les 2 brins complémentaires. coupe une des 2 amorces pour garder seulement un brin.
quel est le principe du séquençage Illumina?
incorporation des toutes les dNTPs avec un fluorophore différent. Arrêt de la polymérase et prise photo. lavage et libération des fluo et terminating groups, recommence cycle
quel est le principe de pacbio?
séquences simple brin passe à travers la polymérase. dNTPs marquer avec fluorophore ralenti la polymérisation = assez de temps pour détecter la fluorescence. Détermine la séquence à l’aide d’un chromatogramme
quel est le principe du ‘real time single molecule sequencing” ?
nano-pores avec 2 protéines, ADN simple brin passe à travers. La deuxième protéine ralenti le passage des nucléotides. altération du courant ionique altérer et déduction de la composition du brin à l’aide des patterns de chaque nucléotides
pourquoi ne pas séquencer tout le génome?
parce que la grande majorité des maladies génétiques se trouvent dans la portion codante (exons). Donc séquence seulement l’exome (21 000 gènes). Aussi, il est difficile d’interpréter les variations génétiques à l’extérieures des régions codantes
quels sont les principales étapes de l’analyse bioinformatique?
alignement des séquences sur le génome de référence, détections de variations, annotation des variations, filtrer les variations
combien de mutations novo par génome par génération?
0 à 4
quels sont les limitations de NGS?
exons riches en GC faible couverture (problème PCR), peu fiable pour détecter/compter les répétitions de nucléotides (microsatellites), difficulté à aligner les séquences et détecter les variations de régions à très fortes homologie , répétée ou pseudogènes, difficulté à détecter la délétion d’un ou de quelques sur un des deux chromosomes
