méthodes moléculaires I Flashcards
qu’est ce qui cause l’instabilité génétique et la variation du nombre de dinucléotides?
une mutation dans les enzymes de réparations
le nbr de copies de dinucléotides varient ainsi d’une cellule à l’autre
comment la chimiothérapie 5-FU est-elle affectée?
MMR reconnait base modifiée 5-FU et induit l’apoptose de la cellule, mais si MMR défectueux = flop
conditions d’utilisation du PCR ?
lorsqu’on veut cibler plusieurs dinucléotides à la fois pour détecter l’instabilité, une cellule seulement est suffisante
quels sont les caractéristiques de MMR anormal et d’instabilité génétique sur un gel après PCR?
une colonne plus longue que l’autre, la taille des fragments n’est pas pareille
quelles sont les techniques de marquage des fragments d’ADN?
amorce liée à une molécule fluorescente, amorce fluorescente universelle, agent intercalant (non spécifique)
qu’est ce que l’analyse pas électrophorèse capillaire?
on fait une électrophorèse à travers le capillaire (contient du gel). l’ADN issu d’un PCR dans pleins de petits tubes migre vers l’anode (+).
quel problème vient avec l’utilisation du formaldéhyde?
cassures et bris dans les brins d’ADN = PCR beaucoup plus difficile
expliquer les amorces universelles
- introduction d’une amorce avec une queue phagique
2. ajout d’une amorce phagique fluorescente (qui vient s’hydrider à la queue phagique de l’amorce précédente)
comment on évalue l’instabilité génétique avec l’électrophorèse capillaire?
plusieurs pics = plusieurs variations de dinucléotides
quel est le plus grand danger avec un PCR?
une contamination
quel est le principe du PCR en temps réel?
émission de fluorescence durant la réaction de PCR. nécessite un appareil capable d’exciter et de capter la fluorescence émise
qu’est ce que la méthode TaqMan?
Q (quencher) absorbe la lumière. Lorsque enzyme Pol passe= dégrade la sonde, libère la lumière. Chaque sonde à une nucléotide et une lumière associée
par quoi la méthode TaqMan est-elle limitée?
par les filtres d’excitation et d’émission. Les valeurs des différentes sondes doivent être très distante sinon l’émission d’une excite l’autre
comment les sondes taqman discrimine les allèles normales des allèles mutées?
via l’hybridation des nucléotides
conditions d’utilisation de taqman?
DÉTECTION de mutations connues, plusieurs produits PCR en même temps (pls gènes), ne requiert pas d’électrophorèse
à quoi sert le qPCR?
quantification d’une MUTATION par PCR avec amorces allèle spécifique
Avec quoi on quantifie les produits de PCR pour le qPCR?
avec une sonde TaqMan. Allèle mutée vs normal, chacune une couleur et détection de l’intensité du signal
À quoi sert la courbe standard lors de la quantification des mutations?
savoir si la quantité de mutations est significative. plus la courbe franchit le seuil tôt, plus il y a de mutations
savoir mesurer les CT et la quantité de copies de départ
OKI. voir graphique dans les notes
comment on estime le pourcentage de mutants?
nbr de copies mutantes/nbr de copies totales x 100
à quoi sert le RT-qPCR?
quantification d’un gène de fusion. détecte certains points de cassures spécifiques
Quel est l’étape préalable à la détection par amorces complémentaires?
ARNm –> ADNc via réverse transcriptase, oli dt et amorces non-spécifiques
quelle est la sonde utilisée lors de la détection des réactions de réarrangement?
TaqMan (détection des différentes fluorescence)
d’un point de vue clinique, à quoi sert le RT-qPCR?
faire un suivi au niveau du patient (pas diagnostic). BUT: passer en dessous du seuil moléculaire 0.1 (BCR-ABL %)
conditions d’utilisation de RT-qPCR?
permet suivi, réarrangements connus, étape initiale RT, séquence contrôle nécessaire
Qu’est-ce que le CT représente?
le nombres de cycles auxquels la courbe atteint une phase exponentiel
À quoi sert MLPA?
détection d’une délétion / duplication (souvent exons)
quelles composantes retrouve-t-on sur les sondes MLPA?
amorce, “stuffer” et sonde (séquences de nucléotides connus)
Quel est le principe de MLPA?
ont vérifie si deux longues sondes s’hydribent une à coté de l’autre, permettant à la ligase de les liguer. Si elles sont trop loin, la polymérase ne pourra amplifier ce fragment.
À quoi sert le “stuffer” ?
permet de détecter plusieurs délétions en même temps (variation de la grosseur du fragment amplifier)
par quelle analyse on détecte les délétions MLPA?
normalisation de la longueur des fragments (plus facile à voir à l’oeil nu)
