méthodes moléculaires I

Question 1

qu’est ce qui cause l’instabilité génétique et la variation du nombre de dinucléotides?

Answer 1

une mutation dans les enzymes de réparations

le nbr de copies de dinucléotides varient ainsi d’une cellule à l’autre

Question 2

comment la chimiothérapie 5-FU est-elle affectée?

Answer 2

MMR reconnait base modifiée 5-FU et induit l’apoptose de la cellule, mais si MMR défectueux = flop

Question 3

conditions d’utilisation du PCR ?

Answer 3

lorsqu’on veut cibler plusieurs dinucléotides à la fois pour détecter l’instabilité, une cellule seulement est suffisante

Question 4

quels sont les caractéristiques de MMR anormal et d’instabilité génétique sur un gel après PCR?

Answer 4

une colonne plus longue que l’autre, la taille des fragments n’est pas pareille

Question 5

quelles sont les techniques de marquage des fragments d’ADN?

Answer 5

amorce liée à une molécule fluorescente, amorce fluorescente universelle, agent intercalant (non spécifique)

Question 6

qu’est ce que l’analyse pas électrophorèse capillaire?

Answer 6

on fait une électrophorèse à travers le capillaire (contient du gel). l’ADN issu d’un PCR dans pleins de petits tubes migre vers l’anode (+).

Question 7

quel problème vient avec l’utilisation du formaldéhyde?

Answer 7

cassures et bris dans les brins d’ADN = PCR beaucoup plus difficile

Question 8

expliquer les amorces universelles

Answer 8

1. introduction d’une amorce avec une queue phagique

2. ajout d’une amorce phagique fluorescente (qui vient s’hydrider à la queue phagique de l’amorce précédente)

Question 9

comment on évalue l’instabilité génétique avec l’électrophorèse capillaire?

Answer 9

plusieurs pics = plusieurs variations de dinucléotides

Question 10

quel est le plus grand danger avec un PCR?

Answer 10

une contamination

Question 11

quel est le principe du PCR en temps réel?

Answer 11

émission de fluorescence durant la réaction de PCR. nécessite un appareil capable d’exciter et de capter la fluorescence émise

Question 12

qu’est ce que la méthode TaqMan?

Answer 12

Q (quencher) absorbe la lumière. Lorsque enzyme Pol passe= dégrade la sonde, libère la lumière. Chaque sonde à une nucléotide et une lumière associée

Question 13

par quoi la méthode TaqMan est-elle limitée?

Answer 13

par les filtres d’excitation et d’émission. Les valeurs des différentes sondes doivent être très distante sinon l’émission d’une excite l’autre

Question 14

comment les sondes taqman discrimine les allèles normales des allèles mutées?

Answer 14

via l’hybridation des nucléotides

Question 15

conditions d’utilisation de taqman?

Answer 15

DÉTECTION de mutations connues, plusieurs produits PCR en même temps (pls gènes), ne requiert pas d’électrophorèse

Question 16

à quoi sert le qPCR?

Answer 16

quantification d’une MUTATION par PCR avec amorces allèle spécifique

Question 17

Avec quoi on quantifie les produits de PCR pour le qPCR?

Answer 17

avec une sonde TaqMan. Allèle mutée vs normal, chacune une couleur et détection de l’intensité du signal

Question 18

À quoi sert la courbe standard lors de la quantification des mutations?

Answer 18

savoir si la quantité de mutations est significative. plus la courbe franchit le seuil tôt, plus il y a de mutations

Question 19

savoir mesurer les CT et la quantité de copies de départ

Answer 19

OKI. voir graphique dans les notes

Question 20

comment on estime le pourcentage de mutants?

Answer 20

nbr de copies mutantes/nbr de copies totales x 100

Question 21

à quoi sert le RT-qPCR?

Answer 21

quantification d’un gène de fusion. détecte certains points de cassures spécifiques

Question 22

Quel est l’étape préalable à la détection par amorces complémentaires?

Answer 22

ARNm –> ADNc via réverse transcriptase, oli dt et amorces non-spécifiques

Question 23

quelle est la sonde utilisée lors de la détection des réactions de réarrangement?

Answer 23

TaqMan (détection des différentes fluorescence)

Question 24

d’un point de vue clinique, à quoi sert le RT-qPCR?

Answer 24

faire un suivi au niveau du patient (pas diagnostic). BUT: passer en dessous du seuil moléculaire 0.1 (BCR-ABL %)

Question 25

conditions d’utilisation de RT-qPCR?

Answer 25

permet suivi, réarrangements connus, étape initiale RT, séquence contrôle nécessaire

Question 26

Qu’est-ce que le CT représente?

Answer 26

le nombres de cycles auxquels la courbe atteint une phase exponentiel

Question 27

À quoi sert MLPA?

Answer 27

détection d’une délétion / duplication (souvent exons)

Question 28

quelles composantes retrouve-t-on sur les sondes MLPA?

Answer 28

amorce, “stuffer” et sonde (séquences de nucléotides connus)

Question 29

Quel est le principe de MLPA?

Answer 29

ont vérifie si deux longues sondes s’hydribent une à coté de l’autre, permettant à la ligase de les liguer. Si elles sont trop loin, la polymérase ne pourra amplifier ce fragment.

Question 30

À quoi sert le “stuffer” ?

Answer 30

permet de détecter plusieurs délétions en même temps (variation de la grosseur du fragment amplifier)

Question 31

par quelle analyse on détecte les délétions MLPA?

Answer 31

normalisation de la longueur des fragments (plus facile à voir à l’oeil nu)