méthode en histo Flashcards
pouvoir separateur oeil
Pouvoir séparateur = distance la plus petite entre deux points vus séparément
œil = 0,2mm (200μm) MO = 0,2μm (200nm) ( cellule, organite) ME = 0,2nm (molécule)
different type echantillon
cellule vivante
frottis
1-1- Cellules vivantes
-> étude de la viabilité/vitalité cellulaire
pour repérer cell mortes (bleu trypan) ou cell vivantes (sondes fluorescentes)
1-2- Frottis - étalements / cytocentrifugation
pour les liquides ou produits de grattage ou brossage
sur lame
different type echantillon
empreinte
préparation a plat
1-3- Empreintes / appositions
pour les échantillons solides
sur lame
1-4- Préparations à plat
pour les organes fins
sur lame / boite de Pétri
different type echantillon
coupe
le plus souvent, organes trop épais pour observation directe au microscope
nécessité réaliser coupes fines/ultrafines
sur lame (MO) ou grille (MET)
microscope optique préparation standart
differente etapes
= préparation d’un fragment de tissu solide pour examen en MO
Différentes étapes : fixation inclusion coupe coloration montage
MO prepa
fixation
(indispensable pour préserver les structures biologiques), fixateur : acide acétique, paraformaldéhyde
MO prepa inclusion
pour « durcir » l’échantillon afin d’en permettre la coupe, après déshydratation dans des bains d’alcool dans de la paraffine fondu
MO prepa coupe
coupes fines 2 à 10 μm avec un microtome
MO prepa coloration
- Hématéine-Eosine (HE) : H -> noyaux en violet et E -> cytoplasme en rose
- Hématéine-Eosine-Safran (HES) : S -> fibres de collagène en jaune
- Trichrome de Masson : hématoxyline : noyaux en brun
fuchsine acide : cytoplasme en rouge
vert lumière : fibres de collagène en vert
Le microscope optique à contraste de phase
optique a contraste de phase
- met en évidence les différences d’indices de réfraction
- en révélant des différences de phases de la lumière
- permet l’étude des cellules vivantes et préparations MÊME non colorées
Le microscope à fluorescence
Fluorochromes = substances :
- source lumineuse avec sélection de lambda d’excitation
- filtres pour sélectionner les lambda d’émission
Préparation des échantillons pour la ME à transmission (MET)
differente etape
fixation, inclusion, coupe, coloration = augmente contraste
MEt prepa
fixation
- fixation : glutaraldéhyde dans du tampon cacodylate (ou phosphate)
- post-fixation : acide osmique
MEt prepa
inclusion
- après déshydratation
- dans des résines synthétiques
MEt prepa coupe
- coupes ultrafines (50 à 80 nm)
- avec un ultramicrotome
- déposées sur des grilles de cuivre
ME contraste
- acétate d’uranyle (pour noyau, nucléole et ribosomes)
- citrate de plomb (pour les membranes)
Préparation des échantillons pour la ME à balayage (MEB)
differentes etape
fixation, déshydratation, métallisation
MEb fixation
glutaraldéhyde dans du tampon cacodylate pas de post fixation
MEb deshydratation
- par des bains d’alcool de degré croissant
- et par passage au point critique du CO2
MEb metallisation
dépôt d’une couche fine (10 nm) d’or-palladium
hybridation in situ
= a quoi
pour quoi
= utilisation d’une sonde nucléique « marquée »
pour détecter et localiser,
dans les cellules ou les tissus,
une séquence spécifique d’ADN ou d’ARN,
séquence complémentaire de celle de la sonde
hybridation in situ
differente etape
1e tps : dénaturation de l’ADN et de la sonde 2e tps : hybridation 3e tps : lecture, fonction du « marqueur »
hybridation in situ
sonde
La sonde est marquée par :
- des isotopes radio-actifs = « sondes chaudes »
- des produits non radio-actifs = « sondes froides »
- fluorochromes FISH = Fluorescence In Situ par Hybridation
- enzymes (phosphatase alcaline), biotine, digoxigénine
- or colloïdal pour MET
Autoradiographie
= a quoi et pour quoi
= utilisation de précurseurs des macromolécules
marqués avec des isotopes radioactifs
pour repérer les sites de synthèse
et étudier le cheminement
de composés biologiques
autoradiographie different temps
1e tps : incorporation in vivo / in vitro du précurseur du métabolisme à étudier
2e tps : confection des préparations
3e tps : autoradiographie (émulsion photosensible appliquée plusieurs semaines sur la préparation)
4e tps : développement et lecture du film (au microscope
ME a transmission
capture image
Le microscope électronique à transmission
- source de rayonnement = filament qui génère des électrons
- lentilles = solénoïdes générant un champ électrique
- recueil des électrons traversant la préparation
- fonctionne sous vide
- résolution supérieure car ldes électrons inférieure
La capture d’images
- film photo
- caméra numérique
ME a balayage
Le microscope électronique à balayage
- cf. MET mais recueil des électrons réfléchis par la préparation
Histochimie
déceler et localiser, sur des préparations histologiques,
les substances organiques et minérales, en particulier les constituants biochimiques (lipides, glucides et protides),
à partir de réactions chimiques
Glucides et réaction à l’acide périodique de Schiff (PAS)
révélation des aldéhydes par le réactif de Schiff -> coloration rouge pourpre
histoenzymologie
= déceler / localiser des activités enzymatiques (et non les enzymes elles-mêmes)
en mettant en évidence le produit de leur action
sur un substrat spécialement fourni :
1e tps : incubation des cellules vivantes / coupes à congélation
histo enzymo
a activite estérases
Activité des estérases (étude de la viabilité cellulaire)
- la calcéine AM, substrat non fluorescent, traverse les membranes cellulaires ;
- dans le cytoplasme des cellules vivantes, elle est estérifiée en calcéine ;
- la calcéine est fluorescente et ne traverse pas les membranes cellulaires
histo enzymo
a activité des peroxydases
Activité des péroxydases
la péroxydase (endogène), en présence d’eau oxygénée
oxyde la diaminobenzidine (DAB) -> précipité brun noir
histoenzymo a activité ATPasique
Activté ATPasique
L’ATPase, en présence de chlorure de cobalt-> phosphate de cobalt
Phosphate de cobalt, en présence de sulfure d’ammonium, -> sulfure de cobalt qui précipite
-> Les CMStSq « lentes » sont colorées en noir et les « rapides » en beige
immunohisto
=
utilisation d’un anticorps (Ac), Ac monoclonal (AcM) essentiellement,
pour détecter et localiser très spécifiquement 1 protéine
Immunohisto complexe AG-AC
revele par quoi
- soit par un fluorochrome (techniques d’immunofluorescence) : Fluorescéine (FITC) emission : 520 nm
Phycoérythrine (PE) emission: 580 nm - soit par une enzyme (techniques immunoenzymatiques) : ex péroxydase, phosphatase alcaline
- soit par de l’or colloïdal
Immunohisto complexe AG-AC
revele par quoi
pour la ME
par l’intermédiaire d’une protéine
- soit de façon directe
- soit de façon indirecte
- parfois après amplification
