méthode en histo Flashcards
pouvoir separateur oeil
Pouvoir séparateur = distance la plus petite entre deux points vus séparément
œil = 0,2mm (200μm) MO = 0,2μm (200nm) ( cellule, organite) ME = 0,2nm (molécule)
different type echantillon
cellule vivante
frottis
1-1- Cellules vivantes
-> étude de la viabilité/vitalité cellulaire
pour repérer cell mortes (bleu trypan) ou cell vivantes (sondes fluorescentes)
1-2- Frottis - étalements / cytocentrifugation
pour les liquides ou produits de grattage ou brossage
sur lame
different type echantillon
empreinte
préparation a plat
1-3- Empreintes / appositions
pour les échantillons solides
sur lame
1-4- Préparations à plat
pour les organes fins
sur lame / boite de Pétri
different type echantillon
coupe
le plus souvent, organes trop épais pour observation directe au microscope
nécessité réaliser coupes fines/ultrafines
sur lame (MO) ou grille (MET)
microscope optique préparation standart
differente etapes
= préparation d’un fragment de tissu solide pour examen en MO
Différentes étapes : fixation inclusion coupe coloration montage
MO prepa
fixation
(indispensable pour préserver les structures biologiques), fixateur : acide acétique, paraformaldéhyde
MO prepa inclusion
pour « durcir » l’échantillon afin d’en permettre la coupe, après déshydratation dans des bains d’alcool dans de la paraffine fondu
MO prepa coupe
coupes fines 2 à 10 μm avec un microtome
MO prepa coloration
- Hématéine-Eosine (HE) : H -> noyaux en violet et E -> cytoplasme en rose
- Hématéine-Eosine-Safran (HES) : S -> fibres de collagène en jaune
- Trichrome de Masson : hématoxyline : noyaux en brun
fuchsine acide : cytoplasme en rouge
vert lumière : fibres de collagène en vert
Le microscope optique à contraste de phase
optique a contraste de phase
- met en évidence les différences d’indices de réfraction
- en révélant des différences de phases de la lumière
- permet l’étude des cellules vivantes et préparations MÊME non colorées
Le microscope à fluorescence
Fluorochromes = substances :
- source lumineuse avec sélection de lambda d’excitation
- filtres pour sélectionner les lambda d’émission
Préparation des échantillons pour la ME à transmission (MET)
differente etape
fixation, inclusion, coupe, coloration = augmente contraste
MEt prepa
fixation
- fixation : glutaraldéhyde dans du tampon cacodylate (ou phosphate)
- post-fixation : acide osmique
MEt prepa
inclusion
- après déshydratation
- dans des résines synthétiques
MEt prepa coupe
- coupes ultrafines (50 à 80 nm)
- avec un ultramicrotome
- déposées sur des grilles de cuivre
ME contraste
- acétate d’uranyle (pour noyau, nucléole et ribosomes)
- citrate de plomb (pour les membranes)
Préparation des échantillons pour la ME à balayage (MEB)
differentes etape
fixation, déshydratation, métallisation
MEb fixation
glutaraldéhyde dans du tampon cacodylate pas de post fixation
MEb deshydratation
- par des bains d’alcool de degré croissant
- et par passage au point critique du CO2
MEb metallisation
dépôt d’une couche fine (10 nm) d’or-palladium
hybridation in situ
= a quoi
pour quoi
= utilisation d’une sonde nucléique « marquée »
pour détecter et localiser,
dans les cellules ou les tissus,
une séquence spécifique d’ADN ou d’ARN,
séquence complémentaire de celle de la sonde
hybridation in situ
differente etape
1e tps : dénaturation de l’ADN et de la sonde 2e tps : hybridation 3e tps : lecture, fonction du « marqueur »
hybridation in situ
sonde
La sonde est marquée par :
- des isotopes radio-actifs = « sondes chaudes »
- des produits non radio-actifs = « sondes froides »
- fluorochromes FISH = Fluorescence In Situ par Hybridation
- enzymes (phosphatase alcaline), biotine, digoxigénine
- or colloïdal pour MET
Autoradiographie
= a quoi et pour quoi
= utilisation de précurseurs des macromolécules
marqués avec des isotopes radioactifs
pour repérer les sites de synthèse
et étudier le cheminement
de composés biologiques
