Maturation et régulation post-transcriptionnelle des ARN

Question 1

Étapes majeures de la maturation des ARNm eucaryotes

Answer 1

• Transcription
• Adjonction de la “coiffe” et polyadénylation
• Épissage

Question 2

Structure de la coiffe

Answer 2

• À l’extrémité 5’
• 7-Méthyl guanosine ajouté via pont 5’-5’ triphosphate
• Ajouté avant que l’ARNm n’atteigne 30 nt de longueur

Question 3

Enzymes responsables de l’ajout de la coiffe

Answer 3

• RNA triphosphatase
• guanylyl transferase (partie GMP de GTP)
• Methyltransferase (adds a methyl group from AdoMet
• Methyltransferase (adds another methyl

Question 4

Fonctions de la coiffe

Answer 4

• Protège l’ARN de la dégradation par exonucléases 5’-3’
• Aide dans l’Exportation des ARNm du noyau
• Augmente efficacité de traduction de l’ARNm
• Contribue à l’épissage approprié de l’ARNm

Question 5

Polyadénylation à l’extrémité 3’ des ARNm

Answer 5

• Pré-ARNm eucaryotes ont région 3’ variable (terminaison de transcription imprécise).
• L’ajout d’une queue poly-A (~250nt) permet de corriger ces différences dans l’ARNm mature.
• Ajouté via 2 réactions:
  -Clivage 10-35nt après AAUAAA ou <50nt avant le site G/U riche.
  -Synthèse de chaîne poly-A par la poly-A polymérase (PAP)

Question 6

Fonctions de la polyadénylation

Answer 6

• Protège l’ARNm de la dégradation
  par exonucléases 3’®5’. (la chaîne poly-A raccourcit durant la vie de l’ARNm).
• Peut stimuler la traduction dans certains systèmes. (circularisation de l’ARNm via interaction avec coiffe)
• Aide dans l’exportation des ARNm du noyau.
• Sur d’autres types d’ARN (i.e. tRNA, snRNA, rRNA, snoRNA, ARN bactériens), l’ajout de poly-A peut cibler la dégradation via l’exosome/dégradosome.

Question 7

Mécanisme moléculaire de l’épissage

Answer 7

1. Groupe 2’-OH d’un résidu A spécifique d’un intron produit une attaque nucléophile sur le phosphate en 5’ à la frontière en 5’ de l’intron pour donner une liaison 2’,5’-phosphodiester inhabituelle et sond une structure en lasso
2. Le groupe 3’-OH libre forme une liaison 3’-5’-phosphodiester avec le résidu en 5’ terminal de l’exon 3’, épissant ainsi les deux exons et libérant l’intron sous forme d’un lasso

Question 8

Splicéosome

Answer 8

Splicéosome
*Complexe RNP formé de >100protéines et 5 petits ARNs. *Formé de 5 sous-complexes snRNP,
recrutés de manière dynamique au
cours du ‘cycle de l’épissage’
*Métalloenzyme qui coordonne deux
ions Mg2+ au site actif.

Question 9

Type Épissage alternatif

Answer 9

a) SÉlection de site d’épissage alternatif en 5’
b) Sélection de site d’épissage alternatif en 3’
c) Inclusion ou exclusion d’exon ‘cassette’
d) Exclusion ou rétention d’un intron

Question 10

Back-splicing

Answer 10

Épissage alternatif qui peut mener à la production d’ARN circulaire

Question 11

Trans-régulater

Answer 11

Protéine ou ARN qui reconnait les éléments Cis (Épissage, Polyadénylation, Traduction, localisation, stabilité)

Question 12

Recrutement des facteurs de maturation des ARN via l’interaction avec l’ARN pol II

Answer 12

Domaine C-terminal (CTD) de RPB1 de l’ARN Pol II eucaryote:
-Séquence heptapeptidique YSPTSPS répétée (26x levure, 52x humain) et phosphorylée sur résidus Sérine, Thréonine et Tyrosine.
-La phosphorylation de ces résidus est dynamique durant la transcription et permet le recrutement de Trans-régulateurs impliqués dans la maturation des ARN.

Question 13

Rôle du CTD de l’ARNP

Answer 13

Recrutement des complexes de remodelage (capping complex et splicing complex)

Question 14

mécanisme alternatif de ciblage protéique

Answer 14

Localiser et traduire l’ARNm dans une région spécifique de la cellule

Question 15

Avantages de localiser les ARNm

Answer 15

• Économie d’énergie. Une molécule d’ARNm peut générer beaucoup de copies de protéines.
• Empêche la protéine d’aller dans un compartiment inapproprié.
• Capacité à moduler composition protéique localement en réponse à l’environnement.
• Assemblage co-traductionnel de complexes protéiques.

Question 16

Technique d’hybridation in Situ

Answer 16

1. Préparation de sondes ARN ou ADN complémentaires à l’ARNm cible:
   - Incorporation de nucléotides marqués
   - Permet reconnaissance par l’Ac dirigés contre la marque
2. Hybridation de la sonde sur tissus, cellules ou organismes fixés et perméabilisés
3. Ajouter l’Ac qui reconnait la marque sur la sonde. Ac souvent conjugué avec enzyme permettant amplification du signal
4. Incubation avec substrat chromogénique ou fluorescent

Question 17

Grandes étapes de la localisation des ARNm

Answer 17

1. Deux ARNm encodés par des gènes fonctionnellement reliés (G1 and G2). 2. Un facteur protéique reconnait des éléments de régulation en cis dans ces ARNm (e.g. séquence primaire ou structure secondaire).
2. Les ARNm sont exportés du noyau au cytoplasme.
3. Ensuite, ils sont transportés au cortex pour être traduits localement. Les protéines encodées s’associent en complexe.
4. Les ARNm pourraient aussi jouer un rôle non-codant (e.g. fonction d’échafaudage).
5. Les sites de localisation des ARNm pourraient aussi servir de sites de storage de transcripts prêts à être traduits.

Question 18

Ribosome

Answer 18

Démontre que les ARN ribosomaux forment une portion majoritaire du ribosome (2/3 de la masse).
* Protéines ribosomales surtout à la surface externe, alors que centre catalytique pour l’activité peptidyl transferase est principalement formé d’ARNr.

Question 19

Régulation des aRN ribosomaux procaryote

Answer 19

• Les ARNr sont encodés par les Opérons rrn, qui contiennent une copie de chaque gène d’ARNr (5S, 16S et 23S) et jusqu’à 4 copies de gènes encodant des ARNt.
• ARN primaire polycistronique clivé en pré-ARNr par endonucléases (ARNase III, P, E, F).
• La maturation finale des pré-ARNr implique clivage par ARNases secondaires (D, M16, M23, M5) et se fait après association avec protéines ribosomales.
• Les ARNr 16S et 23S sont flanqués de séquences complémentaires permettant la formation de structures tige boucle.
• Cette portion d’ARN double brin est clivée par l’ARNase III qui coupe spécifiquement l’ARN double brin.

Question 20

Régulation des ARN ribosomaux Eucaryotes

Answer 20

• Les gènes ARNr répétés plusieurs centaines de fois dans le génome au niveau du nucléole. (Transcrits par l’ARN polymérase I).
• Synthèse d’un ARNr précurseur et
  étapes de clivage dans le nucléole.
• Étapes de maturation dictées par petits ARN nucléolaires (snoARN).
• Maturation du transcrit primaire des ARNr nécessite modifications par les snoARNs.
• Les snoARNs sont des petits ARN de 60-100 nt qui dérivent des introns des ARNm.
• Les snoARNs s’apparient à des sites spécifiques sur pré-ARNr et guide 2 principaux types de modifications:
• Méthylation sur 2’OH du ribose.
• Pseudouridylation de certaines Uridines.
• Ces modifications vont dicter étapes de maturation du pré-ARNr.
• L’ARNr 5S est transcrit par l’ARN
  polymérase III dans le nucléoplasme.

Question 21

Auto-épissage

Answer 21

• ARNr 26S du protozoaire Tetrahymena.
• Introns de type I sont des ribozymes.

Question 22

Maturation des ARN de transfert

Answer 22

• Les ARNt matures font ~80nt, avec structure en forme de trèfle.
• Transcrits par l’ARNP III sous forme de longs précurseurs, excès d’ARN enlevé aux côtés 5’ et 3’.
• Chez procaryotes, environ 60 ARNt organisés seuls ou agrégats dans le génome (certains dans opérons d’ARNr).
• Chez eucaryotes, plusieurs centaines de gènes d’ARNt organisés seuls (certains contiennent un petit intron).
• À part l’épissage, le processus de maturation est semblable chez procaryotes et eucaryotes.

Question 23

Étapes de la maturation des ARN transfert

Answer 23

• Étape 1: coupure du côté 5’ par l’ARNase P (enzyme formé de sous-unité catalytique ARN: ribozyme).
• Étape 2: clivage du côté 3’ par ARNases. (3’tARNses chez eucaryotes).
• Étape 3: ajout de la séquence CCA à l’extrémité 3’ par tRNA nucléotdidyl transférase. Site ou les acides aminés seront attachés.
• Modifications de plusieurs bases par méthylation, conversion d’adénosines en inosines et de pseudo-uridylations (ψ).

Question 24

Phénomène d’interférence par ARN

Answer 24

L’interférence par ARN (RNAi) est un processus par lequel de petites molécules d’ARN , de source exogène ou endogène, peuvent moduler l’expression génique, typiquement en causant la dégradation ou l’inhibition d’un long ARN complémentaire.

Question 25

Mécanisme des ARN interférents

Answer 25

• Étape 1: coupure d’un ARN double brin (dsRNA) précurseur en petits ARN interférents [short interfering RNA (siRNA)] de 21-23 nt par l’enzyme Dicer.
• Étape 2: Incorporation des siRNA dans complexe RISC (RNA-Induced Silencing Complex). Le RISC contient une protéine de la famille Argonaute.
• Étape 3: Association du complex RISC avec ARNm cible via appariement avec siRNA.
• Étape 4: Clivage de l’ARNm cible via l’actvité endonucléase du RISC (conféré par protéine Argonaute).

Question 26

Outil de recherche: interférence aux ARN

Answer 26

• Identifie les gènes impliqués dans différents processus biologiques
• Des collections d’ARN interférents (ou leurs précurseurs) sont organisées en plaques multi-puits.
• Dans chaque puits, on traite nos cellules/organismes avec un siARN différent spécifique pour un ARNm précis.
• Ensuite on détermine les conséquences du traitement sur le processus biologique qui nous intéresse (par exemple: marquage des cellules par immunofluorescence, viabilité ou comportement de l’organisme, etc).

Question 27

Mécanismes d’action des miARNs

Answer 27

• Appariement imparfait
• Appariement parfait

Question 28

Appariement imparfaits des miARNs

Answer 28

Inhibe la traduction de l’ARNm en protéine

Question 29

Appariement parfait des miARN

Answer 29

Induit la dégradation de l’ARNm cible

Question 30

CRISPR

Answer 30

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats.

Question 31

Cas

Answer 31

gènes encodant protéines régulatrices (nucléases, polymérases, hélicases, etc).

Question 32

Mécanisme d’Action du système CRISPR/Cas

Answer 32

• Immunisation: Après infection avec ADN exogène (e.g. virus, plasmide), un complexe de protéines Cas reconnait l’ADN étranger. Ceci permet d’intégrer un nouvel élément ‘espaceur’, dérivé de l’ADN étranger, dans le locus CRISPR à l’extrémité L.
• Immunité : Lors de la trancription du locus CRISPR, l’ARN précurseur (pre) est clivé en petits ARN (crARN), qui sont utilisés pour guider la machinerie Cas vers l’ADN étranger, afin de l’inactiver.

Question 33

Système CRISPR/Cas pour éditer les génomes

Answer 33

• On peut utiliser le système CRISPR/Cas pour induire des cassures ADN double-brin à des endroits précis du génome. On peut ensuite prendre avantage des mécanismes endogènes de réparation de l’ADN pour modifier la séquence du génome.
• Approche utilisée pour corriger défaut génétique d’un modèle murin de Dytrophie Musculaire de Duchenne.