Maria - interaction proteine - AN Flashcards
Principe de la filtration sur nitrocellulose ?
AN capable de passer a travers une membrane de nitrocellulose tandis que les protines restent adsorbées dessus / du coup si AN est adsobé, interaction avec Prot. Attention : avoir un controle est important.
Comment mettre en évidence l’interaction séquence spécifique d’une prot ?
filtration nitrocell avec un ADN db compétiteur non marqué, mais disparait quand on le met en présence d’un ADN compétiteur non marqué de séquence identique à la sonde.
Principe du retard sur gel ?
On fait migrer une prot et un AN sur un gel NATIF : si il migre moins loin que l’ADN seul, alors c’est interaction.
quels controles pour gel retard ?
proteine + sonde toujours mais avec un compétiteur spécifique, un non compétiteur, ou un anticorps.
Principe de la gel filtration ?
On met la protéine avec la sonde ADN ou ARN pusis on sépare par gelfiltration. on cherche ensuite à détecter la sonde dans les éluats, puis on compare aux profils d’élution des protéines seules.
Principe du photo crosslinking ?
On me tla protéine en présence d’une sonde AN, puis irradiée aux UV. on traite ensuite le mélange avec une nucléase, puis SDS page autoradiographique et finale,ent WB.
Qu’est ce que le North Western ?
On sépare la protéine sur un gel SDS et on transfère sur membrane saturée par de la BSA. Puis, on révèle avec l’ARN marqué.
Qu’est ce que le South Western ?
On sépare la protéine sur un gel SDS et on transfère sur membrane saturée par de la BSA. Puis, on révèle avec l’ADN marqué.
Qu’est ce que l’AN pull down et co IP ?
On met protéine et AN en contact, puis on immunoprécipite la protéine. On cherche ensuite les AN par PCR, hybridation etc. On peut faire la version avec un AN étiqueté qu’on détectera avec une chromato d’affinité.
CHiP ?
Permet di’dentifier et quantifier des séquences d’ADN capables de fixer une protéine. Peut coupler à du séquencage.
Comment détecter l’interactio AN prot par microarray ?
On fixe les AN sur des plaques, puis on ajoute les protéines et on les détecte après lavage.
Peut on faire de la RPS pour AN Prot ?
Oui.
Principe du DNase I footprint ?
On fixe la protéine sur le fragment d’ADN puis on traite à la DNase. Il restera une ombre ou la séquence n’est pas coupée car elle a été protégée par la protéine. On peut ensuite faire migrer les fragments obtenus sur gel pour trouver l’ombre.
Principe de la protection RNase H ?
On prend des sondes, marquées por hybrider l’ARN cible. La RNase H va reconnaître la séquence ou ça s’hybride et la couper (vu que double brin). Si la protéine qui interagit avec l’ARN s’était fixée à cet endroit, y’aura pas de clivage. On détermine le site d’interaction avec précision en réalisant une microbanque d’oligos qui s’hybrident à cet ARN cible à différents endrotis.
Principe du Par-Clip ? Avantage ?
Avantage : c’est in vivo. C’est pour identifier entre ARN et protéine, mais il faut pouvoir IP la protéine.
On utilise des analgoues rNTP photoactivables, qui se cross linkent avec des UV et induisent une mutation. Le traitement à la RNase H élimine les fragments d’ARN qui n’ont pas fixé de protéines. Puis, on isole la prot en la IP, puis SDS pour isoler le complexe, et on lyse la protéine pour récupérer juste le fragment d’ARN qui interagissait avec. On RT et on obtient la séquence en sachant précisément quels nt interagissent avec la prot le mieux (via mutations).
