MAP Übung

Question 1

Was ist Transformation?

Answer 1

• genetische Veränderung durch Gentransfer mittels Aufnahme freier DNA

Question 2

Was bedeutet Kompetenz?

Answer 2

• physiologischer Zustand in dem Bakterien über die Fähigkeit verfügen freie DNA aufzunehmen
• Kompetenz genetisch reguliert und ausgelöst durch
  
  • Nährstofflimitation und
  • B. subtilis durch Quorum sensing bei vielen Individuen
• viele Stämme müssen künstlich kompetent gemacht werden, da nur geringe natürliche Kompetenz
  
  • Kalziumionen und abkühlen
  • Elektroporation

Question 3

Wie läuft die Transformation ab?

Answer 3

• kompetente Zelle bindet DNA Teilstücke mit DNA Bindeprotein an Zelloberfläche
• Aufnahme Doppel- oder Einzelstrang
  
  • bei ds Abbau eines Stranges
• Schutz der DNA durch Bindung von kompetenzspezifischen Protein
• ssDNA erreicht Chromosom und wird mittels RecA homolog rekombiniert

Question 4

Wie wurde die DNA aus B. subtilis isoliert?

Answer 4

• Probe mit Lysozy versetzt
  
  • Abbau Zellwand, Bildung Protoplast
• Zugabe SDS (Natriumdodecylsulfat)
  
  • Auflösen der Membran, Lyse der Zellen
• NaCl hinzufügen
  
  • Aussalzen der Proteine
• Natriumdesoxycholat-Lösung hinzugeben
  
  • Emulgieren der Lipide
• Zentrifugieren
  
  • Abtrennen von Proteinen und Lipiden
• Chloroform / Oktanol hinzufügen
  
  • restliche Proteine denaturieren
• Zentrifugieren
  
  • restliche Proteine abtrennen
• eiskalten Ethanol hinzufügen
  
  • Fällung DNA an Grenzschicht

Question 5

Wie wird die Transformantenhäufigkeit bestimmt?

Answer 5

• Frage: Wie viele Transformanten pro kompetente Zellen pro ml → x / cfu
• gegeben: 19 Transformanten, 108 Zellen
• Wie viel Transformanten X pro ml?
  
  • 0,5 ml Ausgangslösung → *2
  • Ausgangslösung mit 0,5 ml LB vermischt, davon 0,2 ml ausplattiert → *5
  • x = 19 * 2 * 5
• Wie viel kompetente Zellen pro ml?
  
  • 0,1 ml der Ausgangssuspension + 0,9 ml Saline → *10
  • diese wurde auf 10^-6 verdünnt und ausplattiert →*10⁶
  • cfu = 108 * 10 * 10⁶
• Transformantenhäufigkeit = (19*2*5) / (108*10*10⁶)

Question 6

Welche Stämme wurden auf Grund ihrer Stoffwechselaktivität differenziert und welche Tests wurden vorgenommen?

Answer 6

• E. coli, A. vinelandii, P. putida, P. stutzeri
• Wachstum auf Benzoat
• Bildung von Siderophore
• Test auf Cytochrom c

Question 7

Wie verläuft der Test auf Wachstum auf Benzoat?

Answer 7

• manche Stämme können aromatische Verbindungen als Kohlenstoffquelle nutzen
• P. putida und A. vinelandii können Benzoat nutzen (Wachstum erkennbar)
• Intermediat ist Catechol, Ringöffnung erfolgt auf verschiedene Möglichkeiten
• A. vinelandii wandelt mit Catechol-2,3-Dioxygenase Catechol zu 2-Hydroxymuconatsemialdehyd um welches gelbe Farbe aufweist
• beim Besprühen mit Catechol tritt Gelbfärbung ein

Question 8

Wie funktioniert der Test auf Siderophore

Answer 8

• Moleküle zur Aufnahme von Eisen
• Fe³⁺ nur schwer löslich, Fe²⁺ liegt in oxidierender Umwelt kaum vor
• P. putida gibt Pyroverdine ins Medium ab (fluoreszierende Siderophore)
• unter UV Licht sichtbar

Question 9

Wie funktioniert der Test auf Cytochrom c? (Oxidasetest)

Answer 9

• Test auf vollständige Atmungskette mit 4 Komplexen und Cytochrom c
• verkürzter Atmungskette fehlen Komplexe 3 und 4 und somit auch Cytochrom c
• beim Besprühen der Kolonien mit N,N,N′,N′-Tetramethyl-1,4-phenylendiamin reduziert dieser Indikator vorhandenes Cytochrom c und es stellt sich eine blaue Färbung ein
• nur E. coli negativ

Question 10

Welche Reaktionen gehören zur IMViC Reihe?

Welche Stämme wurden getestet?

Answer 10

• Indolbildung
• Methylrotprobe
• Voges-Proskauer-Test
• Citratverwertung
• zusätzlich Gasbildung
• E. coli und R. terrigena

Question 11

Wie funktioniert der Test auf Indolbildung?

Answer 11

• Nachgewiesen wird das Vorhandensein von Indol
• Entsteht bei dem Abbau von Tryptophan neben Pyruvat und Ammonium
• Indol bildet mit Kovacs Reagenz roten Farbstoff Rosindol
• E. coli +
• R. terrigena -

Question 12

Wie funktioniert die Methylrotprobe?

Answer 12

• Nachweis von sauren Gärungsprodukten (Aufzucht unter Sauerstoffmangel) durch pH-Indikator Methylrot
• bei pH < 4.5 Rotfärbung
• E. coli +
• R. terrigena -

Question 13

Wie funktioniert der Voges-Proskauer Test?

Answer 13

• Nachweis von Acetoin, was bei 2,3-Butandiolgärung als Intermediat entsteht
• Acetoin reagiert zu Diacetyl was mit im Pepton enthaltenen Kreatin zu alpa-Napthol reagiert (rotbraune Färbung)
• E. coli -
• R. terrigena +

Question 14

Wie funktioniert der Test auf Citratverwertung?

Answer 14

• Citrat als Kohlenstoffquelle kann von R. terrigena aufgenommen werden
• wird im Citratzyklus zu alpha Ketoglutarat decarboxyliert
• für Decarboxylierung wird dem Medium ein Proton entzogen
• dadurch wird Medium alkalisch, was durch zugegebenen Indikator Bromthymolblau angezeigt wird
• E. coli -
• R. terrigena +

Question 15

Wie funktioniert der Test auf Gasbildung?

Answer 15

• Durhamröhrchen werden mit Proben beimpft und unter Luftausschluss inkubiert
• E. coli bildet bei Gärung relativ wenig Gas
  
  • äquimolare Mengen CO₂ H₂
• R. terrigena produziert bei er 2,3-Butandiolgärung große Mengen an CO₂
• Daher mehr Gas bei R. terrigena

Question 16

Was sind virulente Phagen?

Answer 16

• Viren nehmen direkt den lytischen Zustand ein, vermehren ihre DNA, verpacken diese und lysieren die Zelle

Question 17

Was sind temperente Phagen?

Answer 17

• Phagen die sich sowohl lytisch als auch lysogen verhalten können

lytisch:

• nach Injektion wird DNA repliziert und neue Viren gebildet bis zur Lyse des Wirtes

lysogen:

• virale DNA wird in Wirts-DNA integriert
• Überdauerung als inaktiver Prophage und Vermehrung durch Zellteilung des Wirtes
• durch Induktion Übergang in lytischen Zustand

Question 18

Wie gelang die DNA des Phagen Mu in die Wirtszelle?

Answer 18

• lineare DNA wird in Wirt injiziert
• Integration in Wirts-DNA durch Transposition an beliebiger Stelle
• Einahme des lysogenen Zustandes
• Repressor c verhindert Ablesen der DNA, keine Transposition oder Lyse möglich

Question 19

Wie geht der Phage Mu in den lytischen Zustand über?

Answer 19

• durch Inaktivierung des Repressors c
• dadurch werden Gene zur replikativen Transposition expremiert
  
  • Kopien der Phagen-DNA werden in Wirts-DNA eingefügt (50 bis 100)
• Expremieren später Gene führt zur Bildung von Phagenköpfen und -körpern
• Sobald Phagen-DNA verpackt erfolgt die Lyse

Question 20

Wie wurde der Versuch mit dem Phagen Mu durchgeführt?

Bestimmung Phagentiter

Answer 20

• Verwendung einer Mutanten des Phagen Mu
• Repressor c wird ab 43°C deaktiviert
  
  • dadurch Übergang in den lytischen Zustand
• 0,1 ml Phagen werden in Verdünnungsstufen 10^-5 bis 10^-8 zu einer Kultur E.coli (sensitiv gegenüber Mu) gegeben
• Inkubation bei 43°C
• Bildung von Plaques an den Stellen an denen der Phage Mu die Wirte lysiert
• Berechnung pfu (plaque forming units):
  
  • Verdünnung zurückrechnen
  • 19 Plaques bei 10^-7
    
    • 19 * 10 * 10⁸ = 1,9 *10⁸

Question 21

Wie wurde der Versuch mit dem Phagen Mu durchgeführt?

Gewinnung Insertionsmutanten

Answer 21

• Vermischung von E.coli und Phagenlysat auf LB Vollmedium
• Inkubation bei 30°C
• Überlebende Zellen werden gemäß einem Raster auf GN MInimalmedium und LB Vollmedium übertragen
• auxotrophe Mutanten werden auf GN Medium nicht wachsen auf LB Vollmedium jedoch schon