Manipulation des acides nucléiques Flashcards
Solubilité de l’ADN
ADN est très soluble dans l’eau car: molécule très chargée + peu de groupements hydrophobes
Sa solubilité varie avec: conditions salines + présence de substances organiques dans l’eau
Propriétés physico-chimiques utilisées pour purifier les acides nucléiques:
- Polymères dont la taille change avec le nombre de nucléotides
- Composés d’une forte charge négative
- Adoptent une structure en double brins
Façon habituelle de précipiter l’ADN
La précipitation à l’éthanol pour le concentrer ou changer son tampon
Processus de la précipitation de l’ADN
- ajout de 2.5 volumes d’éthanol à une solution contenant de l’ADN + 0.25M d’acétate de sodium (pour éviter la séparation des doubles brins d’ADN)
- la solution est mise à -20 degrés pendant min 30min et l’ADN est récupéré par centrifugation à 10 000rpm pendant 10 min à 4 degrés dans une microcentrifugeuse
- une certaine qtt de sel sera aussi précipitée avec l’ADN. Des lavages avec l’éthanol permettra de les enlever.
- Autre solv org. utilisé pour la précipitation: isopropanol
Extraction de l’ADN au phénol
Méthode de répartition de phase:
Les acides nucléiques sont retrouvés dans la phase aqueuse et les protéines, pour la plupart dénaturées, partitionnent dans le phénol, la phase plus dense, et à l’interface des 2 phases.
Processus de la méthode de partition de phase
- pH de l’éthanol est ajusté à 8 (ADN partiellement soluble ds le phénol acide)
- Agiter 1 vol du phénol neutralisé avec 1vol de la solution contenant de l’ADN et extraire 2 fois
- Les traces résiduelles de phénol peuvent être éliminées par extraction avec du chloroforme immédiatement après
Le chloroforme est éliminé par précipitation avec de l’éthanol
Protéases souvent utilisées pour dégrader les protéines et faciliter leur extraction au phénol
Électrophorèse de l’ADN
- Chargés négativement–> peuvent migrer ds gel électrophorèse
- Grande taille –> acides nucléiques pénètrent difficilement ds gels de polyacrylamide (pour purification/analyse d’acides nucléiques de qq centaines de nucléotides seulement)
-
Gels d’agarose utilisés pour purifier/analyser les acides nucléiques
(perm séparation fragments ADN à plusieurs milliers nucléotides)
Agarose est dissous ds un ampon, bouilli. Qd se refroidit, polymérise directement et forme un gel.
Électrophorèse ADN - processus
- ADN est chargé dans les puits + migrera vers l’anode
- Tampon EDTA utilisé pour inhiber activité des nucléases (pH=8)
- Séparation se fait selon masse moléculaire de l’ADN, dépend de la taille des fragments d’ADN
- Fragments petits migrent plus vide que les grands
Visualisation ADN dans gel d’électrophorèse
Pour colorer les bandes d’ADN : colorants comme bromure d’éthidium, cancérigène
= molécules aromatiques cationiques planaires qui s’intercalent entre les bases
Qd elles sont intercalées, elles fluorescent + intensément qu’à l’état libre
Chromatographie des acides nucléiques
Chromatographie..
- ÉCHANGE D’IONS: charge négative donc échangeur anionique utilisé
- FILTRATION SUR GEL: pour dessaler les oligonucléotides
- D’AFFINITÉ: pour purifier les ARNm des cell eucaryotes
Ultracentrifugation + purification de l’ADN
Méthode pour purifier/séparer ADN = ultracentrifugation sur gradient de chlorure de césium
- densité de flottaison de l’ADN ds un grandient dépend de sa composition en bases
technique utilisée pour: séparer ADN nucléaire, mitochondrial ou chloroplastique + séparer les plasmides de l’ADN chromosomal des bactéries
