La chromatographie Flashcards
Phase mobile/stationnaire
La chromatographie est basée sur:
- l’utilisation d’une phase mobile, qui contient le mélange de substances à fractionner +
- une phase stationnaire, au travers de laquelle les substances sont séparées
Les interactions des diff subst. avec la phase stationnaire ralentissent plus ou moins leur migration au travers de cette phase selon les propriétés respectives de chaque substance
Quelles sont les propriétés communément utilisées pour faire le fractionnement?
- Les interactions ioniques (chromatographie par échanges d’ions)
- La taille (chromatographie par gel-filtration)
- La spécificité (chromatographie d’affinité)
Explication des échanges d’ions
Ds un processus d’échange d’ions, les ions liés électrostatiquement à un support insoluble (R) sont remplacés de manière réversible par des ions en sln.
R+A- = échangeur d’anions, sous la forme A-
Un échangeur de cations porte des groupes chargés négativement et lierait des cations de manière réversible
L’affinité avec laquelle une protéine se lie à un échangeur d’ions dépend de…
- pH de la sln, car la charge nette des prot varie selon le pH
- de la nature et de la concentration des autres ions en sln, qui vont aussi compétitionner pour les sites de liaison de l’échangeur d’ions
Les échangeurs utilisés en chromatographie des protéines dépendent de 2 caractéristiques:
- La nature de leur matrice
- Le type de groupement fonctionnel utilisé pour favoriser l’attachement de la protéine
Quelles sont les matrices?
Des polymères insolubles préparés sous formes de billes = résines
Les polymères les + utilisés: polysaccharides, comme cellulose, dérivés du cellulose, de l’agarose + autres polymères
Pourquoi les polymères (matrices) sont poreux?
Les polymères sont suffisamment poreux pour permettre la pénétration d’une protéine et le réseau de pores génère une surface bcq + large que la surface extérieure de la bille
Les groupements fonctionnels
Les échangeurs d’ions exploitent la présence d’une charge nette sur la protéine à un pH donné qui leur permettent d’interagir par attraction électrostatique
Les classes d’échangeurs + les groupes
2 classes d’échangeurs
1. Échangeurs anioniques (portent charge +)
2. Échangeurs cationiques (ont une charge -)
Chc classe d’échangeurs se divise en grp
- Échangeur fort (reste pleinement chargé entre pH 3-10)
- Échangeur faible (chargé dans une gamme de pH plus restreint)
Quelles sont les groupements chimiques greffés sur les matrices + leur groupe?
QAE: (pka=9.5) échangeur anionique fort
Sulfonate: échangeur cationique fort
DEAE: (partiellement chargé à partir pH 7-8) échangeur anionique faible
CM: (pleinement chargé à partir de pH 4.5) échangeur cationique faible
Liaison à la colonne - contre-ions
Les prot se lient aux échangeurs par des forces électrostatiques.
- Les charges de l’échangeur sont contrebalancées par des contre-ions (ions métalliques, sel, tampon)
- Une prot doit déplacer les contre-ions pour s’attacher
- Comme la prot est neutralisée par des contre-ions, la prot doit avoir une + grande affinité pour l’échangeur que pour les contre-ions qu’elle doit déplacer
- Le pH et la conc saline de la sln ds laquelle la prot est dissoute sont choisis de sorte que cette prot se trouve immobilisée sur l’échangeur d’ion
Lavages
Une fois la sln de prot est appliquée sur le haut de la colonne contenant l’échangeur, la colonne est lavée avec une sln tampon
Les différentes protéines se lieront à l’échangeur d’ions avec des affinités différentes…
- Les prot avec une affinité faible pour l’échangeur d’ions migreront plus vite dans la colonne
- Plus l’affinité de liaison d’une protéine pour l’échangeur est forte, plus la migration sera retardée
C’est quoi l’élution fractionnée?
= Les prot liées à l’échangeur d’ions peuvent être éluées par un tampon de concentration saline supérieure au tampon de lavage
KCl ou NaCl utilisés pour l’élution
Le sel déplace directement la protéine: les ions occupent les sites chargés devenus disponibles et bloquent le rattachement de la protéine
C’est quoi l’élution par gradient?
L’utilisation d’un gradient linéaire, où la conc saline de la sln d’élution varie de façon linéaire avec le volume qui passe dans la colonne
- permet de libérer les diff prot liées à l’échangeur d’ions selon leur affinité
Chromatographie par gel-filtration: les 3 principes
Pores / Limite d’exclusion / Vitesse
- Phase stationnaire (résine) = réseau de polymères réticulé possédant des pores, fabriqués sous forme de billes
- Les pores dans les billes du gel sont assez grands pour permettre la pénétration complète des petites molécules mais ils ne laissent pas pénétrer tt les prot à partir d’une certaine taille (limite d’exclusion)
- Les prot qui ne pénètrent pas dans les pores traversent la colonne plus rapidement que les protéines retenues dans les pores des billes
Chromatographie par gel-filtration
Quelles sont les matrices?
sont faites de polymères insolubles à base de polysaccharides comme le dextrane (Sephadex) ou l’agarose (Sépharose) ou de polyacrylamide (Bio-Gel), préparées sous la forme de billes réticulées (poreuses)
Chromatographie par gel-filtration
La porosité des gels dépend de..
- Masse moléculaire du polymère
- Nombre de liaisons croisées qui se forment entre les molécules du polymère (pontages)
Chromatographie par gel-filtration
Limite d’exclusion
Limites d’exclusion=
Les meilleures billes de gel ont des tailles de pore qui excluent 90% des macromolécules qui possèdent 5-6 fois la taille des macromolécules retenues dans le volume interstitiel des billes
Les limides d’exclusions:
- Sephadex: 0.8-800kDa
- Sepharose: 40 000kDa
Chromatographie par gel-filtration
C’est quoi le volume d’élution?
Le volume d’élution d’une protéine dans une colonne de gel-filtration peut être déterminé quantitativement, = volume de solvant nécesssaire pour éluer la protéine après son dépot sur la colonne
Chromatographie par gel-filtration
Volume d’élution relatif, formule
Vt=Vo + Vx
Volume total de la colonne=Volume mort (volume de slv qui entoure les billes) + Volume occupé par les billes
Volume d’élution relatif d’une protéine permet d’estimer la masse moléculaire d’une protéine
- relation linéaire entre volume d’élution relatif d’une prot et le log de sa masse moléculaire
Rôle de la dialyse
Séparer les molécules selon leurs tailles grâce à l’utilisation de membranes semi-perméables qui présentent des pores de taille inférieure aux protéines
- Ces pores permettent aux petites molécules de diffuser à travers la membrane, mais pas aux plus grosses molécules
- Membranes utilisées sont à la base de cellophane (cellulose)
Utilisation de la dialyse
Utilisée pour éliminer les sels présents dans un échantillon de protéine obtenu après précitation (salting out) ou après élution avec un tampon riche en sels d’une colonne de chromatographie par échange d’ions
Étapes pour la dialyse
La sln de prot + sels est mise dans un sac à dialyse, puis immergé dans un large volume de tampon. Après plusieurs heures, les sln se retrouvent à l’équilibre grâce à la diffusion des sels de l’intérieur du sac vers le tampon de dialyse
Chromatographie d’affinité: c’est quoi
Un ligand qui lie spécifiquement la protéine d’intérêt est fixé de manière covalente à une matrice poreuse et inerte
Chromatographie d’affinité: comment récupérer la protéine (ligant)?
- on peut récupérer la prot désirée sous une forme pure en modifiant les conditions d’élution pour faire en sorte que la prot se détache du liant.
- Soit: ajoutant excès de ligand libre dans la colonne, ou en changeant le pH, la force ionique, ou la température
Chromatographie d’affinité
Avantage de la chromatographie d’affinité (avec ligand)
- Exploite les propriétés biochimiques uniques de la prot d’intérêt, au lieu d’untiliser des propriétés physico-chimiques qui sont aussi partagées par d’autres protéines
- Peut purifier la prot d’intérêt à un très haut degré de pureté en une seule étape
Interaction protéine-ligand
Constante de dissociation: c’est quoi?
Kd: mesure de l’affinité protéine-ligand
P+L –> P-L
kd
La qtt de protéine retenue sur la colonne (PLM) dépendra:
- Du Kd
- De la concentration de protéine dans l’extrait
- Du degré de liaison du ligand à la matrice
La matrice utilisée pour la chromatographie d’affinité doit être:
- chimiquement inerte
- avoir une grande porosité
- présenter de nombreux groupes fonctionnels capables de former des liens covalents avec les ligands
(Agarose = polymère le + utilisé)
Étapes de la liaison ligand sur matrice d’agarose
- Rx de l’agarose avec du bromure de cyanogène qui produit 1 intermédiaire activé et stable
- Le ligand réagit avec l’agarose activé pour donner un produit lié par covalence
Problème: plusieurs protéines incapables de se lier à leur ligand couplé au bromure de cyanogène pcq….
À cause de l’interférence stérique avec la matrice d’agarose
Pour éviter ce problème, un bras espaceur souple ajouté entre matrice et ligand
Méthodes de détection des protéines lors de l’élution d’une colonne chromatographique
Pour détecter quantitivement + spécifiquement dans les fractions de l’.l
- Absorption des protéines dans l’UV avec un spectrophotomètre (prot absorbent lumière 280nm, méthode non spécifique)
- Essai colorimétrique (Bradford): Contient un produit qui rend la sln mauve en réagissant avec les protéines (l’intensité de la couleur est proportionnelle à la conc) - méthode non spécifique
- Essai enzymatique: pratique avec enzyme
- Gel SDS-PAGE (avec colorant): permet de déterminer le degré de pureté de la protéine
- Anticorps (essai ELISA ou immunoblot): très spécifique
