Isolation des protéines Flashcards
Première étape dans la purification des protéines
Les dissoudre dans une phase liquide
Les protéines en général doivent être libérées des cellules où elles se trouvent
Lyse osmotique - c’est quoi?
La méthode la plus douce et la plus simple: la lyse osmotique, où les cellules sont resuspendues dans une solution hypotonique
La différence de concentration résulte dans l’établissement d’une pression osmotique qui provoque le gonflement puis l’éclatement de la cellule
Efficacité de la lyse osmotique avec quel type de cellules?
- Plus efficace avec cellules animales (n’ont pas de paroi cellulaire)
- Avec les cell bactériennes, de levures ou végétales, l’utilisation de lysozyme, une enzyme qui dégrade les parois cellulaires, est nécessaire
Quelles sont les techniques de désintégration mécanique? (5)
–> pour briser les cell et avoir accès à leur contenu interne
- Broyage avec du sable + alumine + petites billes de verre
- Déchiquetage mécanique (blender de type Waring)
- Homogénéisateur (Potter de téflon)
- Rupture par haute pression (French press)
- Sonication par vibration ultrasonique
Facteurs de stabilisation des protéines lors de leur purification (3)
- pH : utilise des sln tampon qui maintiennent le pH dans une zone physiologique (6.5-8) pour éviter d’endommager les protéines des variations brusques
- Température :
- les prot sont facilement dénaturées à hautes températures
- plusieurs prot se dénaturent lentement lorsque conservées à 25 degrés
- purification des prot se fait à 0-5 degrés
- une fois purifiées, les prot peuvent se conserver à long terme à des températures de -20 à -80 - Protéases : Les cell contiennent des protéases (hydrolysent liens peptidiques). Protéases sont libérées lors de la lyse cellulaire + peuv dégrader les prot lors de la purification (ajout d’inhibiteurs de protéases)
Quelles sont les propriétés physico-chimiques exploitées dans les diff techniques de séparation?
*prot purifiées par méthodes de fractionnement
- Solubilité
- Charge ionique
- Taille moléculaire
- Propriétés d’absorption et de liaison à d’autres molécules biologiques
Technique(s) de séparation de la propriété physico-chimique suivante: solubilité
+
expliquer la technique
Précipitation =
diminuer sélectivement la solubilité de la protéine dans l’eau
La distribution des résidus d’AA de types hydrophobe à la surface des prot est aussi importante dans la solubilité des prot que les résidus de type polaires ou chargés
Technique(s) de séparation de la propriété physico-chimique suivante: charge ionique
- chromatographie par échanges d’ions
- électrophorèse
- focalisation isoélectrique
Technique(s) de séparation de la propriété physico-chimique suivante: taille moléculaire
- ultracentrifugation
- chromatographie par gel-filtration
- électrophorèse
Technique(s) de séparation de la propriété physico-chimique suivante: spécificité
chromatographie d’affinité
La solubilité d’une protéine dépend de … ?
- Des interactions polaires avec le solvant aqueux
- Des interactions ioniques avec les sels en solution
- Des forces électrostatiques répulsives entre molécules ou agrégats de charge similaire
*Ces facteurs augmentent les interactions avec la sln et diminuent les interactions protéines-protéines, empêchant l’agrégation des protéines
Expliquez ce concept:
La précipitation exige la formation d’agrégats de protéines (3 éléments)
- À partir d’une cert. taille d’agrégats, cette force n’est pas suffisante pour contrecarrer celle de la force gravitationnelle, ce qui mène à la précipitation
- Le solvant utilisé dans l’isolement des protéines est tjr aqueux, mais ses propriétés peuvent être changées pour que la solubilité d’une protéine soit modifiée.
- Les variations utilisées pour diminuer la solubilité d’une protéine sont: force ionique + ajout de solvants organiques + pH + ajout de polymères inertes
La force ionique + la relation entre solubilité d’une protéine et concentration de sels en solution
La solubilité des protéines en solution aqueuse dépend de la concentration en sels dissous.
- Cette conc. en sels est exprimée par la force ionique ( I=1/2 ∑ci Zi^2)
En général, la solubilité d’une protéine varie selon la nature des ions en solutions et augmente avec la concentration de sels en solution
Qu’est-ce que le salting in?
Dans la zone de 0 à 0.5M, l’augmentation en solubilité avec une conc. croissante en sels = salting in
- À ces conc., les sels lient directement les protéines et augmentent leur charge nette, ce qui favorise leur solubilité, car
1. Les sels augmentent les interactions avec l’eau
2. Les sels augmentent la répulsion entre protéines (diminue agrégation)
Que signifie: dessaler la protéine par dialyse?
La solubilité des prot. globulaires décroît avec la diminution de la conc. de sel.
Cette propriété est utile pendant la purification, qd on veut dessaler la protéine par dialyse.
La dialyse contre un tampon de faible force ionique peut provoquer la précipitation des protéines
C’est quoi le salting out?
Le dessalage ou salting out d’une protéine à de hautes concentrations de sel est une des techniques les + utilisées en purification des protéines
Ce phénomène est dû à la compétition entre les ions salins ajoutés et les protéines pour la solvatation (=accès aux molécules d’eau)
Expliquez le processus du salting out
- L’hydratation des ions de sels a une forte tendance à séquestrer les molécules d’eau
- La séquestration de l’eau –> diminution de la solvatation des protéines
- Une fois une qtt suffisante de molécules d’eau sequestrée, les prot. ont moins de surface solvatée, ce qui favorise leur agrégation
Pourquoi le dessalage est-il largement une fonction de l’hydrophobicité de la protéine?
Les régions hydrophobes seront les 1ères à être moins bien solvatées.
(Il y a une + grande tendance pour la protéine de perdre des molécules d’eau autour des résidus hydrophobes, ce qui favorise l’agrégation, car les régions hydrophobes exposées préfèrent interagir entre elles plutôt qu’avec l’eau)
Quels sont les 2 sortes de sels utilisés pour la précipitation des protéines?
- Sels chaotropiques : Sels qui se lient et interagissent directement avec la protéine peuvent avoir un effet déstabilisant
- Sels optimaux : Encouragent l’hydratation des régions polaires et la déshydratation des régions hydrophobes chez une protéine sans avoir aucune interaction avec la protéine.
C’est quoi la série Hofmeister?
A démontré que certains ions favorisent la précipitation des protéines à haute conc (salting out) et à basse conc (salting in)
Quel sel est utilisé le plus souvent en précipitation de protéine?
Le sulfate d’ammonium
(NH4)2SO4
Quel est le rôle de la précipitation isoélectrique?
Permet de purifier une protéine sélectivement en amenant le pH au point isoélectrique de cette protéine
Explication du pH isoélectrique
au pH isoélectrique, une protéine a tendance à devenir moins soluble: une prot avec une charge globale nette près de 0 minimise la répulsion électrostatique + permet aux forces électrostatiques locales de prédominer menant ainsi à une attirance entre les molécules
–> agrégation
–> précipitation
Précipitation des protéines avec des solvants organiques
Quelle influence a un solvant miscible à l’eau à un mélange?
L’addition d’un solvant miscible avec l’eau (ex éthanol/acétone) à un mélange contenant des protéines diminue leur solubilité
Précipitation des protéines avec des solvants organiques
La constante diélectrique
Le pouvoir de l’eau de solubiliser une macromolécule chargée décroît avec la conc. du solvant organique dans la solution
Ceci serait attribuable à une réduction de la constante diélectrique de l’eau
Constante diélectrique = pouvoir de solvatation de l’eau pour des ions dissous (comme des prot)
Précipitation des protéines avec des solvants organiques
Quel facteur détermine la solubilité dans un slv aqueux/organique?
La taille de la protéine!
+ grande est la prot, + basse est la conc en slv organique nécessaire afin de la précipiter
- Les prot + larges ont une + grande surface, donc une meilleure chance d’avoir une région à la surface chargée qui est complémentaire avec une autre prot.
