Isolation des protéines Flashcards
Première étape dans la purification des protéines
Les dissoudre dans une phase liquide
Les protéines en général doivent être libérées des cellules où elles se trouvent
Lyse osmotique - c’est quoi?
La méthode la plus douce et la plus simple: la lyse osmotique, où les cellules sont resuspendues dans une solution hypotonique
La différence de concentration résulte dans l’établissement d’une pression osmotique qui provoque le gonflement puis l’éclatement de la cellule
Efficacité de la lyse osmotique avec quel type de cellules?
- Plus efficace avec cellules animales (n’ont pas de paroi cellulaire)
- Avec les cell bactériennes, de levures ou végétales, l’utilisation de lysozyme, une enzyme qui dégrade les parois cellulaires, est nécessaire
Quelles sont les techniques de désintégration mécanique? (5)
–> pour briser les cell et avoir accès à leur contenu interne
- Broyage avec du sable + alumine + petites billes de verre
- Déchiquetage mécanique (blender de type Waring)
- Homogénéisateur (Potter de téflon)
- Rupture par haute pression (French press)
- Sonication par vibration ultrasonique
Facteurs de stabilisation des protéines lors de leur purification (3)
- pH : utilise des sln tampon qui maintiennent le pH dans une zone physiologique (6.5-8) pour éviter d’endommager les protéines des variations brusques
- Température :
- les prot sont facilement dénaturées à hautes températures
- plusieurs prot se dénaturent lentement lorsque conservées à 25 degrés
- purification des prot se fait à 0-5 degrés
- une fois purifiées, les prot peuvent se conserver à long terme à des températures de -20 à -80 - Protéases : Les cell contiennent des protéases (hydrolysent liens peptidiques). Protéases sont libérées lors de la lyse cellulaire + peuv dégrader les prot lors de la purification (ajout d’inhibiteurs de protéases)
Quelles sont les propriétés physico-chimiques exploitées dans les diff techniques de séparation?
*prot purifiées par méthodes de fractionnement
- Solubilité
- Charge ionique
- Taille moléculaire
- Propriétés d’absorption et de liaison à d’autres molécules biologiques
Technique(s) de séparation de la propriété physico-chimique suivante: solubilité
+
expliquer la technique
Précipitation =
diminuer sélectivement la solubilité de la protéine dans l’eau
La distribution des résidus d’AA de types hydrophobe à la surface des prot est aussi importante dans la solubilité des prot que les résidus de type polaires ou chargés
Technique(s) de séparation de la propriété physico-chimique suivante: charge ionique
- chromatographie par échanges d’ions
- électrophorèse
- focalisation isoélectrique
Technique(s) de séparation de la propriété physico-chimique suivante: taille moléculaire
- ultracentrifugation
- chromatographie par gel-filtration
- électrophorèse
Technique(s) de séparation de la propriété physico-chimique suivante: spécificité
chromatographie d’affinité
La solubilité d’une protéine dépend de … ?
- Des interactions polaires avec le solvant aqueux
- Des interactions ioniques avec les sels en solution
- Des forces électrostatiques répulsives entre molécules ou agrégats de charge similaire
*Ces facteurs augmentent les interactions avec la sln et diminuent les interactions protéines-protéines, empêchant l’agrégation des protéines
Expliquez ce concept:
La précipitation exige la formation d’agrégats de protéines (3 éléments)
- À partir d’une cert. taille d’agrégats, cette force n’est pas suffisante pour contrecarrer celle de la force gravitationnelle, ce qui mène à la précipitation
- Le solvant utilisé dans l’isolement des protéines est tjr aqueux, mais ses propriétés peuvent être changées pour que la solubilité d’une protéine soit modifiée.
- Les variations utilisées pour diminuer la solubilité d’une protéine sont: force ionique + ajout de solvants organiques + pH + ajout de polymères inertes
La force ionique + la relation entre solubilité d’une protéine et concentration de sels en solution
La solubilité des protéines en solution aqueuse dépend de la concentration en sels dissous.
- Cette conc. en sels est exprimée par la force ionique ( I=1/2 ∑ci Zi^2)
En général, la solubilité d’une protéine varie selon la nature des ions en solutions et augmente avec la concentration de sels en solution
Qu’est-ce que le salting in?
Dans la zone de 0 à 0.5M, l’augmentation en solubilité avec une conc. croissante en sels = salting in
- À ces conc., les sels lient directement les protéines et augmentent leur charge nette, ce qui favorise leur solubilité, car
1. Les sels augmentent les interactions avec l’eau
2. Les sels augmentent la répulsion entre protéines (diminue agrégation)
Que signifie: dessaler la protéine par dialyse?
La solubilité des prot. globulaires décroît avec la diminution de la conc. de sel.
Cette propriété est utile pendant la purification, qd on veut dessaler la protéine par dialyse.
La dialyse contre un tampon de faible force ionique peut provoquer la précipitation des protéines
