Électrophorèse Flashcards
C’est quoi l’électrophorèse?
L’électrophorèse, la migration d’un ion dans un champ électrique, est utilisée dans les séparations analytiques des molécules biologiques
Force électrique
Pour qu’une molécule puisse migrer dans un champ électrique, Félect > Ffriction
Selon les lois électrostatiques, la Félectrique = qE
(=ion avec charge q dans un champ électrique d’intensité E)
Force de friction + Coefficient de friction
La migration électrophorétique de l’ion à travers de la sln est opposée par une force de friction : Ffriction=vf
(vitesse de migration / coefficient de friction)
Coefficient de friction donne une mesure de la résistance exercée par la sln sur l’ion pendant sa migration
Dépend de: taille, forme de l’ion + viscosité de la sln
Mobilité électrophorétique
Chaque ion se déplace avec une vitesse caractérisée par une mobilité électrophorétique, u=V/E = q/f
Cette équation indique que les protéines à leur point isoélectrique (q=0) ont une mobilité électrophorétique nulle
Quelle est la méthode d’électrophorèse la + couramment utilisée?
Électrophorèse en zones
= une technique dans laquelle l’échantillon est contraint à se déplacer dans une phase solide, comme le papier filtre, la cellulose ou un gel
À quoi sert l’électrophorèse en zones?
Par cette technique…
1. On élimine largement l’agitation provoqueée par la convection, un facteur limitant du point de vue résolution
2. Cette technique requiert une qtt faible de matériel permettant la migration des composantes en bandes discrètes.
Électrophorèse sur gel
Expliquer le principe
- 1 des techniques les + puissantes et faciles dans la séparation des macromolécules
- Gels d’usage commun = agarose + polyacrylamide, ont des pores de taille des protéines à séparer
- Séparation moléculaire basée sur: filtration sur gel + mobilité électrophorètique des molécules
Électrophorèse sur gel
Pourquoi les gels d’électrophorèse retardent les molécules de taille + grande?
Inverse de la filtration par gel
Pcq dans la filtration par gel, il y a des espaces pour le solvant entre les billes de gel, ce qui n’existe pas dans l’électrophorèse sur gel
La migration des grandes molécules est retardée par rapport aux molécules plus petites
Électrophorèse par gel de polyacrylamide - fabrication
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Gels sont fabriqués à partir d’une polymérisation d’acrylamide + N,N’-méthylènebisacrylamide dans un tampon
Caractéristiques/Étapes de l’électrophorèse par gel de polyacrylamide
- Avant que le mélange rxionel n’ait durci, il est coulé dans un récipient formé de 2 plaques de verres et polymérisera en une couche mince de gel
- Les échantillons sont déposés ds les puits
- Le tampon est le mm dans les réservoirs du haut et du bas (pH=9 pr que tt les prot. aient une charge négative)
- Un courant continu de 100 à 200V parcourt le gel pendant la migration
Les protéines migrent vers l’anode + selon leur ratio charge/masse
Plus le gel est long,meilleure est la finesse des bandes et de la résolution
Rôle électrophorèse en pH discontinu
Afin d’augmenter la résolution et donc restreindre les protéines dans des bandes plus minces, le gel peut être modifié en utilisant 2 gels dans des tampons différents:
1. Gel de séparation, préparé comme autre gel
2. Gel de concentration, qui surmonte le gel de séparation et qui est de plus haute porosité
- Le tampon ds le réservoir du bas et celui du gel de séparation sont identiques
- Le tampon du gel de concentration a un pH de 2 unités de moins
- Le pH du tampon dans le réservoir supérieur doit contenir un acide faible (glycine) et son pH est ajusté près de celui du réservoir inférieur
Processus de l’électrophorèse en pH discontinu
- Glycine est de charge neutre, augmente la résistance au courant électrique, loi de Ohm (E=IR) résistance R plus élevée avec un courant I constant = augmentation du champ électrique E (augmentation de la vitesse de migration des protéines)
- Passage d’un gel de 5% à 10% acrylamide ralenti la migration électrophorétique à la jonction des 2 gels (compaction des protéines en fines bandes)
- Glycine devient chargée négativement, résistance électrique R diminue, diminution du champ électrique E (diminution vitesse de migration des protéines, séparation des protéines en fct du ratio charge/masse)
SDS-PAGE
C’est quoi
- Dépend du fait que savons/détergents, avec leurs interactions hydrophobes, peuvent dénaturer la structure de la prot
Mécanisme d’action du Sodium dodecyl sulfate (SDS) - chaîne polypeptide
- = détergent puissant
- SDS se lie de façon importante aux protéines; conc de 0,1% de SDS suffisante pour saturer par liaison avec une chaîne polypeptide à un taux de 1 molécule de détergent par 2 résidus d’AA
- En présence d’SDS, les prot contenant des sous-unités sont désunies et la chaîne polypeptide de chc sous-unité adopte une conformation étendue
Mécanisme d’action du Sodium dodecyl sulfate (SDS) - Charge négative
- La forte charge - apportée par SDS masque la charge intrinsèque des protéines
- Conséquemment, le rapport charge/masse sera le mm pour tt les protéines de mm masse et la séparation électrophorétique du gel avec du SDS dépendra uniquement du phénomère de gel-filtration par les pores du gel
- Cette méthode donne la meilleure résolution et les bandes sont les + résolues de tt les méthodes d’analyse
