Manipolare il genoma: le biotecnologie Flashcards
Che cosa sono le biotecnologie?
BIOTECNOLOGIE = applicazioni tecnologiche che utilizzano organismi viventi o loro derivati per realizzare prodotti e processi per usi specifici
- tecnologia del DNA ricombinante –> insieme di tecniche che consentono la manipolazione dell’informazione genetica degli esseri viventi, dando origine a OGM
Quali sono i tre ambiti in cui operano le biotecnologie?
Green biotech –> ambientali
white biotech –> chimico-farmaceutiche
red biotech –> biomediche
Quali sono alcuni esempi di biotecnologie antiche?
Produzione di pane, birra e vino –> fermentazione
domesticazione delle piante e degli animali –> incroci tra specie diverse e selezione della progenie
In cosa consistono i vantaggi delle biotecnologie moderne?
Le specie ottenute per incrocio tradizionale seguono le regole dell’ereditarietà mendeliana andando incontro ad assortimento indipendente
Rispetto alle biotecnologie tradizionali, le biotecnologie moderne offrono molti vantaggi, in quanto sono specifiche:
- sono più efficaci perchè permettono di trasferire solo i geni desiderati
- i geni trasferiti possono provenire anche da specie molto distanti –> si ottengono varietà impossibili da ottenere con gli incroci tradizionali
- agiscono i modo mirato e permettono di ottenere le caratteristiche desiderate con un’alterazione genetica minima (limitata anche a un solo gene)
Qual è la tecnica fondamentale alla base di tutte le applicazioni biotecnologiche moderne?
CLONAGGIO GENICO = tecnica grazie alla quale è possibile generare diversi cloni di cellule batteriche, ciascuno dei quali contiene milioni di copie del gene di interesse
Passaggi fondamentali di un tipico esperimento di clonaggio genico:
- il gene di interesse viene separato dagli altri geni presenti nell’organismo di partenza
- il gene viene inserito in un VETTORE DI CLONAGGIO = molecola di DNA plasmidico modificata –> il risultato dell’inserimento è un DNA ricombinante
- DNA ricombinante viene inserito all’interno di una cellula ospite attraverso il processo di TRASFORMAZIONE
- le cellule trasformate sono disposte su piastre di terreno agar in modo che i singoli batteri siano distanziati –> si utilizza un MARCATORE DI SELEZIONE (gene che conferisce resistenza ad uno specifico antibiotico) per isolare le cellule batteriche che hanno inglobato il plasmide: solo i batteri che contengono il plasmide ricombinante riusciranno a sopravvivere
- all’interno dell cellula trasformata il vettore può replicarsi grazie alla presenza del sito di origine della replicazione del plasmide
Quando il batterio di divide, si genera una colonia di cellule identiche (cloni) –> il gene è stato quindi clonato
Quale tecnica di laboratorio si utilizza per isolare il gene da clonare?
ENZIMI DI RESTRIZIONE (endonucleasi di restrizione) = particolari enzimi capaci di tagliare entrambi i filamenti di una molecola di DNA in corrispondenza di una specifica sequenza bersaglio
- idrolizzano il legame fosfodiesterico tra due nucleotidi adiacenti
- fanno parte dei naturali sistemi di difesa dei batteri che li producono per degradare il DNA dei virus che li infettano
- i frammenti che si ottengono dalla reazione di restrizione sono separati grazie alla tecnica dell’elettroforesi su gel
- danno origine a estremità coesive (sticky ends) o estremità piatte (blunt ends)
Dopo aver isolato un gene da clonare, quale tecnica si utilizza per inserirlo in un vettore plasmidico?
DNA LIGASI = enzima in grado di ricostruire il legame fosfodiesterico tra due nucleotidi adiacenti utilizzando l’ATP (o il NAD) come cofattore
- gli enzimi di restrizione hanno la capacità di formare estremità coesive –> il vettore e il frammento genico da incorporare vengono tagliati entrambi con lo stesso enzima e poi mesclati
- le estremità coesive di entrambi i frammenti possono unirsi spontaneamente formando legami a idrogeno tra le basi
- l’appaiamento tramite legami ad H da origine a una debole unione tra i due filamenti –> si aggiunge DNA ligasi e atp
- le due molecole di DNA si uniscono covalentemente e in modo stabile grazie alla formazione di legami fosfodiestere
Che caratteristiche hanno i plasmidi usati per inserire il gene da clonare nella cellula ospite? In quale modo vengono inseriti all’interno della cellula ospite?
VETTORI PLASMIDICI = molecole di DNA circolare a doppia elica lunghi alcune migliaia di nucleotidi ottenuti da plasmidi batterici naturali tramite manipolazioni genetiche
Possiedono alcune caratteristiche fondamentali:
- origine di replicazione per consentire la replicazione del plasmide
- almeno un gene per la resistenza agli antibiotici –> agisce come marcatore per selezionare le cellule che hanno incorporato il vettore
- sito multiplo di clonaggio (polilinker) in cui sono presenti numerose sequenze di riconoscimento per diversi enzimi di restrizione –> vi viene inserito il frammento di DNA da clonare
TRASFORMAZIONE BATTERICA = processo che sfrutta la capacità dei batteri di inglobare frammenti di DNA se stimolati in modo opportuno (calore o campi elettrici)
MICROINIEZIONE = tecnica utilizzata per inserire DNA esogeno nelle cellule animali iniettandolo
BIOLISTICA (gene gun) = tecnica che permette di sparare il DNA nelle cellule dopo averlo caricato su microproiettili di materiali inerti (oro o tungsteno) –> utilizzato per le cellule vegetali
Che cos’è una genoteca?
LIBRERIE GENOMICHE = collezioni di cloni batterici ciascuno contenente un diverso frammento di DNA –> cloni che, nel loro insieme, racchiudono tutto il genoma di un organismo da cui poi estrarre il frammento di DNA che interessa
- i frammenti genici contengono sia le sequenze codificanti (esoni) sia le sequenze non codificanti (introni)
Che cos’è e come si crea una libreria a cDNA?
Il modo più conveniente per isolare e clonare un gene eucariotico consiste nel partire dal corrispondente mRNA, perchè tutti gli introni sono già stati rimossi durante lo splicing
- non è possibile clonare direttamente una molecola di RNA all’interno di un vettore a DNA -> è prima necessario convertire il filamento singolo dell’mRNA nella sua copia a cDNA
- frammenti sono poi usati per creare una libreria a cDNA che contiene solo i geni espressi della cellula
Procedimento per creare una libreria a cDNA
- mRNA cellulare viene isolato –> le cellule vengono lisate –> estratto ottenuto viene applicato a una resina cromatografica contenenti oligonucleotidi poliT che si appaiano alla coda poliA –> mRNA sibi catturati e separati dalle altre componenti cellulari
- grazie all’enzima TRANSCRITTASI INVERSA dei retrovirus gli mRNA sono convertiti in cDNA
- grazie all’azione della DNA ligasi all’estremità di ogni cDNA sono saldati oligonucleotidi con la sequenza di riconoscimento per un enzima di restrizione
- si trasforma la cellula ospite con la miscela di vettori ottenuti –> si selezionano le cellule grazie al marcatore di selezione –> ogni cellula conterrà un solo cDNA cellulare e nell’insieme i batteri costituiranno la libreria di cDNA
Quale tecnica si usa per ottenere, a partire dalla quantità di genoma contenuta in una genoteca, una quantità di DNA sufficiente a condurre analisi chimiche e manipolazioni genetiche?
PCR = processo che permette l’amplificazione del DNA sfruttando la tendenza di due filamenti di DNA con sequenza complementare ad appaiarsi spontaneamente e la capacità dell’enzima DNA polimerasi di copiare un filamento di DNA stampo.
Consiste nella ripetizione ciclica di 3 passaggi all’interno di un termociclatore:
1. Denaturazione = si porta la miscela di DNA stampo, primer e enzimi a 90 gradi, permettendo alla doppia elica di DNA di aprirsi esponendo i singoli filamenti
2. Ibridazione = a 50 gradi i primer si uniscono ai segmenti iniziali e finali dei filamenti di DNA
3. Allungamento = a 60 gradi i primer non specificamente appaiati si distaccano dai filamenti e una DNA polimerasi termoresistente (Taq polimerasi) inizia la sintesi dei due filamenti complementari
Cosa si intende per impronta genetica? Quali sono le due tecniche forensi che permettono di riconoscerla?
Ogni individuo contiene un’informazione genetica unica e individui diversi presentano minime ma significative differenze di sequenza –> IMPRONTA GENETICA = materiale genomico unico che, se analizzato, permette di stabilire se due campioni di DNA appartengono allo stesso individuo
RFLP e DNA fingerprinting
In cosa consiste la tecnica RFLP?
Analisi dei polimorfismi dei frammenti di restrizione.
Se tra due individui esiste, all’interno di una determinata sequenza, una differenza anche di un solo nucleotide, l’endonucleasi corrispondente non sarà in grado di tagliare i due DNA nello stesso punto –>le due miscele vengono analizzate con elettroforesi su gel
- se i due campioni provengono dallo stesso individuo, i siti di taglio per le endonucleasi saranno identici e la dimensione dei frammenti ottenuti coinciderà
- se i due campioni provengono da individui diversi, sul gel compariranno bande diverse
In cosa consiste la tecnica del DNA fingerprinting?
Tramite la PCR si amplificano delle corte sequenze ripetute in tandem (STR) presenti sul DNA –> si amplificano dei loci, sequenze ripetitive
La probabilità che due persone abbiano frammenti di lunghezza identica per tutti i 13 loci è praticamente nulla.
In cosa consiste il sequenziamento del DNA praticato secondo metodo Sanger?
SEQUENZIAMENTO GENICO = processo che permette di ricostruire l’ordine in cui le basi si susseguono lungo il filamento di DNA
Processo:
1. si isola il gene da sequenziare, lo si amplifica tramite PCR, e lo si inserisce in una miscela contenente una DNA polimerasi, un primer, vari desossiribonucleotidi e una bassa concentrazione di didesossiribonucleotidi (acidi nucleici a cui manca il gruppo ossidrile in posizione 3’, che vengono legati ad un marcatore fluorescente di colore diverso per ogni base azotata)
2. Il filamento di DNA viene denaturato e il primer si lega
3. la DNA polimerasi inizia l’allungamento, fino a quando (casualmente) invece di un acido nucleico normale si lega un didesossiribonucleotide, che impedisce alla polimerasi di continuare la sintesi in quanto non permette ad ulteriori nucleotidi di unirsi
4. il filamento interrotto viene denaturato, insieme a tutti gli altri che nel frattempo sono stati sintetizzati sugli altri filamenti di DNA
5. tramite elettroforesi capillare, i filamenti interrotti vengono fatti migrare verso un catodo –> prima del quale è collocato un rilevatore laser in grado di registrare la sequenza di passaggio dei didesossiribonucleotidi marcati da luce fluorescente
6. dal momento che i primi a migrare saranno i frammenti più brevi, e gli altri attraverseranno il rilevatore in ordine di peso molecolare crescente, la sequenza di passaggio dei didesossiribonucleotidi corrisponde alla sequenza del filamento complementare al filamento analizzato
7. si inverte quindi la sequenza ottenuta ricavando la sequenza originaria
